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Résumé

T-LYMPHOCYTES --- IMMUNOLOGY --- T-LYMPHOCYTES --- IMMUNOLOGY

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The frequency of a CD8 cytolytic T lymphocyte clone, named CTL16, has been measured in blood samples collected from a melanoma patient vaccinated with a MAGE antigen. This patient displayed a complete tumor regression after vaccination. CTL16 does not recognize the MAGE antigen, but is specific for another antigen, not yet identified, present on the tumor cells. This CTL was isolated by stimulating blood lymphocytes with autologous tumor cells. It was repeatedly found in postvaccination PBMC, but not in prevaccination PBMC. Clonotypic PCR specofoc for the TCR α and β chains of CTL16, were used to establish the frequency of this CTL in groups of postvaccination PBMC. The frequency was found to be about 1/25 000 CD8 T cells after vaccination and remained stable during the tumor regression. It decreased (1/100 000 CD8) in the last sample that was analysed, collected more than one year after regression of all melanoma lesions. Prevaccination PBMC will be tested with the clonotypic PCR, in order to confirm that CTL 16 was amplified after vaccination. It proves true, ot would suggest that CTL 16 was activated as a consequence of the MAGE vaccination. CTL 16 may have participated in the tumor rejection observed in the patient. To examine this point, clonotypic PCR will be applied to regressing tumor samples J’ai analysé la fréquence d’un clone de lymphocytes T CD8, nommé CTL16, dans des échantillons de sang prélevés chez une patiente atteinte d’un mélanome. Cette patiente a présenté une régression tumorale complète après vaccination avec un antigène MAGE. Le CTL16 ne reconnaît pas l’antigène vaccinal, mais est spécifique d’un autre antigène, pas encore identifié, présent sur la tumeur. Il a été isolé suite à la stimulation de lymphocytes sanguins avec des cellules tumorales autologues. Il a été retrouvé répété plusieurs fois dans les PBMC prélevés après vaccination, mais n’a pas été retrouvé avant vaccination. Connaissant la séquence des chaînes α et β du TCR du CTL16, j’ai mis au point des PCR spécifiques de chacune de ces chaînes. J’ai ensuite appliqué ces PCR sur l’ADNc extrait de groupes de PBMC prélevés après vaccination pour mesurer les fréquences de ce CTL dans ces échantillons. Les résultats obtenus montrent que le clone est présent à une fréquence de l’ordre de 1/25 000 CD8 après vaccination. Cette fréquence reste stable dans les échantillons prélevés avant ou pendant la régression tumorale. Elle diminue (1/100 000 CD8) dans le dernier échantillon testé, prélevé plus d’un an après régression de toutes les lésions du mélanome. L’échantillon prélevé avant la vaccination n’a pas encore été testé. S’il se confirme que ce clone CTL apparaît dans le sang après la vaccination MAGE, il a peut-être été activé suite à cette vaccination et joue peut-être un rôle dans la régression tumorale. Des échantillons tumoraux prélevés lors de la régression seront analysés pour examiner ce point

T-Lymphocytes --- Clone Cells

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Les lymphocytes T régulateurs (Tregs) sont des lymphocytes T CD4+ spécialisés dans la suppression des réponses immunitaires. Chez les patients cancéreux, les Tregs suppriment l'activité des lymphocytes T capables de détruire les cellules tumorales, ce qui favorise la progression du cancer. Un des mécanismes impliqués dans l'immunosuppression par les Tregs repose sur la production de TGF-β1 actif, une cytokine immunosuppressive. Cette cytokine est produite sous une forme latente, inactive, qui doit être activée pour se lier à son récepteur. Dans les Tregs humains, la protéine membranaire GARP est requise pour activer le TGF-β1, mais elle n'est pas suffisante. Nous cherchons à identifier les protéines qui coopèrent avec GARP dans l'activation du TGF-β1 par les Tregs humains.Des données préliminaires montrent que l'intégrine avβ 38 joue un rôle, mais il semble que d'autres protéines sont également impliquées. Afin d'identifier ces protéines, le laboratoire a d'abord tenté d'identifier des protéines qui interagissent avec GARP, mais aucun des interactants identifiés ne participe à l'activation du TGF-β1 dans les Tregs. L'objectif de mon mémoire est donc de développer une autre approche afin d'identifier des protéines de Tregs humains qui participent à l'activation du TGF-β1, sans passer par l'identification de protéines interagissant avec GARP. Pour ce faire, j'ai construit une bibliothèque d'ADNc de Tregs humains stimulés. J'ai ensuite criblé cette bibliothèque par co-transfection avec un plasmide codant pour la luciférase Firefly sous le contrôle d'un promoteur répondant au TGF-131 dans un clone de cellules 293T qui expriment stablement GARP et le TGF-β1 latent. Ce criblage m'a permis d'identifier 4 ADNc qui augmentent le signal de luminescence Firefly dans ce système rapporteur. Regulatory T cells (Tregs) are immunosuppressive CD4+ T lymphocytes, which modulate the immune system, maintain tolerance to self-antigens and prevent autoimmune diseases. In cancer, Tregs suppress the activity of T lymphocytes that are directed against tumor cells, promoting tumor progression. One of the mechanisms involved in Tregs immunosuppression is the production of the active form of TGF-β1 an immunosuppressive cytokine. This cytokine is produced in a latent, inactive form and has to be activated to bind to its receptor. Inhuman Tregs, the membrane protein GARP is required, but not sufficient to activate TGF-β1. We aim to identify proteins that cooperate with GARP in TGF-P 1 activation by human Tregs Preliminary data showed that the integrin avp8 plays a mie in this activation, but other proteins may also be implicated. To identify such proteins, the !ab of Sophie Lucas tried to identify proteins that physically interact with GARP, but none of those proteins seem to participate in the activation of TGF-β1by human Tregs. The objective of my project is to develop another approach to identify human Treg proteins, which participate in the activation of TGF-P I. To do that, I constructed a cDNA library of stimulated human Tregs and I screened this library in 293T cells transfected with a plasmid encoding the firefly luciferase under the control of a TGF-β1-responsive promoter. This screening lead to the identification of 4 proteins able to increase the luciferase signal in this reporter system.

T-Lymphocytes, Regulatory

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B-lymphocytes. --- T-lymphocytes.

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To understand why anti-tumoral vaccination leads to tumor regressions in only a minority of patients, we wish to be able to study cytokine gene expression in single T cells from cancer patients.
Therefore, we set up a reliable technique to analyze single cells at the transcriptionnal level. It includes micro-aspiration of individual cells, cDNA synthesis, and quantitative PCR carried out with the genetic material from a single cell, without any preliminary amplification. Setting up this methodology with clonal populations of CD4+ and CD8+ T cells stimulated with PMA-ionomycin, we observed strong intercellular heterogeneity in cytokine gene transcription. Analyzing this heterogeneity, we found out that the main explanation, which cannot be demonstrated rigorously, is differences in the kinetics of activation of individual cells.
We then applied our method to the ex vivo analysis of single blood T cells from patients. We observed an important difference in the proportions of IFNg-producing CD8+ T cells : all anti-EBV CD8+ cells from one donor transcribed the IFNg gene, whereas only 12,5% of anti-MAGE-3.A1 CD8+ cells from a melanoma patient did so. The latter cells are quite rare in blood, and our method is so far the only possibility to analyze them. We will pursue our work by trying to understand the reason for this apparent « anergy » of anti-tumoral T cells Afin de comprendre pourquoi la vaccination anti-tumorale mène à la régression de la tumeur chez une minorité de patients, nous avons voulu étudier les profils d'expression de gènes codant des cytokines dans des lymphocytes T individuels provenant de patients atteints de cancer.
Pour ce faire, nous avons dû mettre au point une technique fiable d'analyse transcriptionnelle de cellules individuelles. Celle-ci comprend l'aspiration des cellules une à une, la synthèse d’ADNc, et les PCR quantitatives réalisées à partir du matériel génétique d'une seule cellule, sans amplification préalable. Lors de ces différentes mises au point, qui ont été réalisées sur des populations clonales de lymphocytes T CD4+ et CD8+ stimulés avec un mélange PMA-ionomycine, nous avons observé une forte diversité intercellulaire au niveau de la transcription des gènes codant des cytokines. Nous l'avons alors étudiée. L'explication majeure de cette diversité, qui ne peut en fait être formellement démontrée, est qu'il existe des cinétiques d'activation différentes d’une cellule à une autre.
Nous avons ensuite, grâce à la même méthode, analysé ex vivo des lymphocytes T individuels provenant de patients et nous avons observé une importante différence dans les profils d'expression d'IFNg parmi les cellules en produisant. Tous les lymphocytes T CD8+ anti-viraux provenant d'un donneur transcrivent le gène codant l’IFNg alors que seulement 12,5% des lymphocytes T CD8+ anti-tumoraux provenant d'un patient atteint de mélanome le font. Ces derniers sont très rares dans le sang de ces patients et notre méthode est pratiquement la seule possibilité pour les analyser. Nous souhaitons poursuivre nos recherches afin de comprendre la raison de cette apparente « anergie » des lymphocytes T anti-tumoraux

T-Lymphocytes --- melanoma-specific antigens --- T-Lymphocytes, Cytotoxic --- Cloning, Molecular