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La maladie d’Alzheimer est une démence neurodégénérative qui se caractérise par la formation de plaques séniles et de dégénérescences neurofibrillaires. Les plaques séniles sont des lésions extracellulaires contenant un noyau amyloïde entouré par des neurites dystrophiques. Le composant majeur du noyau de fibre amyloïdes des plaques séniles est un peptide de 42 acides aminés appelé peptide amyloïde ou Aβ. Le peptide amyloïde dérive du clivage protéolytique d’une protéine transmembranaire : le précurseur du peptide amyloïde (APP). Les dégénérescences neurofibrillaires sont composées de faisceaux de filaments organisés en doubles hélices appelées paries hélicoïdales de filaments (PHF). Le constituant majeur des PHF est une protéine associée aux microtubules : la protéine tau. Dans les PHF, la protéine tau est hyperphosphorylée (PHF-tau). L’hyperphosphorylation de tau l’empêche de se lier aux microtubules et de les stabiliser. Cette hyperphosphorylation pourrait être provoquée par le peptide amyloïde ou être secondaire à une anomalie du métabolisme de l’APP. Afin de tester cette hypothèse, nous avons étudié l’état de phosphorylation de tau dans des neurones de rat en culture qui produisent de l’APP et du peptide amyloïde humain après infection avec un adénovirus recombinant contenant le cDNA codant l’APP humain.
Les neurones de rat non infectés produisent de l’APP endogène, mais cet APP de rat n’est pas transformé en peptide amyloïde extracellulaire. Par contre, lorsque l’APP humain est exprimé par les neurones de rat infectés par l’adénovirus recombinant, du peptide amyloïde soluble est produit. Dans ces conditions expérimentales, nous n’avons pas observé de modification de la phosphorylation de tau au niveau de 6 sites différents, en analysant par western blot les cultures contrôles et infectées. Par immunocytochimie, nous n’avons pas observé de modification de la distribution de tau dans les neurones infectés exprimant l’APP humain.
Nos résultats montrent donc que la production d’APP et de peptide amyloïde humain par les neurones de rat en culture ne modifie pas l’état de phosphorylation de tau, contrairement au peptide amyloïde fibrillaire ajouté en concentration importante dans le milieu extracellulaire

Alzheimer Disease --- Amyloid beta-Protein Precursor --- Immunohistochemistry

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Presenilin 1 and 2 (PSI and PS2) are two homologs that form the catalytic core of an enzymatic complex called y­ secretase. Each complex, containing either PSI or PS2, can cleave APP (Amyloid Precursor Protein) and produce the -amyloid peptide (A) that forms the senile plaques found in Alzheimer's disease (AD) brains. Besides APP, several trans-membrane proteins, including Notch, are known to be y-secretase substrates. Notch has an important role in cell-to-cell communication, thus controlling cell proliferation, differentiation and even cell death. The aim of our project is first to analyze the relative implication of both PS in the proteolytic cleavage of APP and Notch. In a second step, our goal is to study the effect of familial AD and catalytically inactivating PS mutations (respectively AT and DA mutations) on those two processes. To do so, different types of mouse embryonic fibroblasts (MEFs) are used. The cleavages are studied in control cell types expressing both PS, but also in cells which are knockout (KO) for both of them (PS double-KO) or one of them (PSI KO and PS2 KO). We also use cells in which a specific PS is stably re-expressed (non mutated/mutated PSI/PS2) in a null PS background. In order to further characterize the relative implication of the two PS in APP and Notch cleavages we use two known inhibitors of y-secretase activity.In order to quantify APP and Notch cleavages, the different cell types are co-transfected with a C99-GVP construct (expressing the C99 intermediate metabolite of APP catabolism harboring a Gal4-VP16 fusion protein), or with a NotchL1E-GVP construct (expressing the NotchL1E intermediate metabolite of Notch catabolism harboring the same Gal4-VP16 fusion protein), and with two reporter genes expressing either Firejly or Reni/la luciferases. The first vector is a reporter gene directly reflecting the cleavage of the APP and Notch constructs by the y-secretase via the binding of the Gal4 domain to responsive elements Gal4RE upstream the Firejly luciferase sequence. The Reni/la luciferase is expressed under the control of a strong promoter, in order to normalize the transfection efficiency between the different cell types. The expression of the APP/Notch constructs in the cells is verified by immunocytochernistry or by Western blotting. The reporter gene trans-activation is measured with the "Dual­ Luciferase® Reporter Assay System". This setup allows a sensitive and an efficient analysis of APP and Notch constructs cleavages in a standardized system.The results obtained in the KO models show that the endogenous PS 1 is more involved in the y-secretase activity than its PS2 homolog. Results from the rescue models, expressing human PS, suggest that the human PSI is also predominant in the y-secrtase activity, and is more sensitive to the tested mutations than its PS2 homolog. Quite strikingly, the results obtained from the catalytically inactive PS and from pharmacological treatments suggest that PS2 may have a role in APP construct cleavage independently of its enzymatic activity, whereas PS1-dependent cleavage requires a native catalytic site. La famille des présénilines (PS) comprend 2 homologues, PS 1 et PS2, qui forment le cœur catalytique du complexe y-sécrétase. Chaque complexe contient PS1 ou PS2 et est capable de cliver l'APP (Amyloid Precursor Protein) pour produire le peptide -amyloïde (A), que l'on retrouve agrégé dans les plaques séniles, une lésion caractéristique de la maladie d'Alzheimer (MA). Outre l'APP, plusieurs protéines membranaires sont substrats de la y-sécrétase , dont le récepteur Notch. Celui-ci joue un rôle important dans la communication entre cellules, dictant leur prolifération, leur différenciation, ou même leur mort.L'objectif de notre projet est d'abord d'analyser l'implication respective des PS dans le clivage des protéines APP et Notch. Par la suite, le but est d'étudier l'effet de mutations des PS responsables de formes héréditaires de la MA (mutations notées AT), et de mutations inactivant le domaine catalytique des PS (notées DA), sur le clivage de leurs substrats. Pour ce faire, différents types de fibroblastes embryonnaires de souris (MEFs) sont utilisés : des cellules à phénotype sauvage (PS wt), mais également des cellules knockout (KO) pour les PS (PS double-KO ou PS dKO) ou pour une seule d'entre elles (PSl KO et PS2 KO). De plus, nous disposons de cellules PS dKO dans lesquelles l'expression de PS I ou PS2 a été restaurée de façon stable (PS double-KO « rescue »), soit sous forme non mutée (wt), soit sous forme mutée (AT ou DA). Enfin, le rôle des y-sécrétases PSI- et PS2-dépendantes dans le clivage de l'APP et de Notch a été évalué en utilisant 2 inhibiteurs pharmacologiques de la y-sécrétase.Pour quantifier les clivages de l'APP et de Notch, les cellules sont co-transfectées avec une construction C99-GVP (formée de C99, catabolite intermédiaire de l'APP, et de la protéine de fusion Gal4-VPI6) ou une construction NotchôE-GVP (formée du catabolite intermédiaire NotcME de Notch fusionné à Gal4-VPI6), et avec 2 gènes rapporteurs luciférase (Firefly et Renilla). Le premier gène rapporteur détecte le clivage des constructions C99-GVP/NotchôE­ GVP par la fixation des domaines Gal4 à des éléments de réponse clonés en amont du gène de la luciférase Firefly. La luciférase Renilla est exprimée sous le contrôle d'un promoteur fort, pour normaliser les différentes efficacités de transfection des cellules. L'expression des constructions C99-GVP/NotcME-GVP dans les cellules est vérifiée par immunocytochimie ou Western blotting et les clivages sont quantifiés par la méthode « Dual-Luciferase® Reporter Assay System », permettant une analyse efficace de ceux-ci au sein d'un système calibré.Les résultats obtenus dans les modèles KO montrent que la PSI endogène des MEFs a une implication préférentielle dans le complexe y-sécrétase par rapport à son homologue PS2. Les résultats issus des modèles « rescue » suggèrent que la PSI humaine est, elle aussi, primordiale dans l'activité y-sécrétase , et est plus affectée par les mutations testées que la PS2. Les observations faites par inhibition de l'activité catalytique des PS (par traitements pharmacologies et par mutations DA) suggèrent que la PS2 peut cliver la construction APP indépendamment d'une activité catalytique, tandis que le clivage réalisé par PSl serait uniquement d'origine catalytique pour les deux substrats étudiés.

Amyloid Precursor Protein Secretases --- Alzheimer Disease

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La maladie d’Alzheimer est une démence neurodégénérative dont la fréquence augmente avec l’âge. Le cerveau des malades est caractérisé par la présence de deux types de lésions neuropathologiques : les dégénérescences neurofibrillaires et les plaques séniles. Le constituant majeur des dépôts amyloïde (βA4). Ce petit peptide dérive d’une protéine transmembranaire nommée le précurseurs du peptide amyloïde (APP). L’étude du métabolisme de l’APP fait l’objet de nombreuses recherches étant donné son implication dans la maladie d’Alzheimer. Différents modèles cellulaires ont permis de mettre en évidence deux voies dans le catabolisme de l’APP.
L’une, dite non amyloïdogène, aboutit à la formation d’APP soluble après clivage protéolytique par l’α-sécrétase au sein du βA4. L’autre, dite amyloïdogène, libère le βA4 de son précurseur après l’action de la β- et γ-sécrétase.
Afin d’étudier le métabolisme de l’APP dans les cellules directement impliquées dans la maladie d’Alzheimer ; des cultures pures de neurones et d’astrocytes ont été mises au point et caractérisées. Pour exprimer une protéine étrangère dans nos deux modèles cellulaires, nous avons choisi l’adénovirus recombinant.
La première partie du travail montre qu’un adénovirus recombinant porteur du gène lacZ d’Escherichia coli codant la β-galactosidase est capable d’infecter des neurones et des astrocytes en culture. En effet, des tests histochimiques révèlent la présence de β-galactosidase dans des cultures de neurones et d’astrocytes préalablement infectées par l’AdRSVβgal. De plus, un test enzymatique a permis d’étudier la cinétique de production de la β-galactosidase après infection des deux types cellulaires. L’adénovirus recombinant est donc un vecteur efficace pour transférer un gène étranger dans les neurones et astrocytes en culture.
La deuxième partie concerne l’étude du métabolisme de l’APP dans des cultures de cellules cérébrales infectées par un adénovirus recombinant pour le gène codant l’APP-695 humain (AdRSVAPP).
Différentes analyses ont permis de mettre en évidence de l’APP soluble dans les milieux de culture des neurones et des astrocytes infectés. Nos résultats suggèrent donc que l’APP humain utilise la voie catabolique non amyloïdogène dans les deux types cellulaires. L’examen de la voie catabolique amyloïdogène s’est révélé très intéressant. En effet, pour des quantités comparables d’APPs produites par les deux types cellulaires, nous avons montré que seuls les neurones sécrétaient du peptide βA4 dans le milieu.
l’ensemble des résultats suggèrent d’une part, que le métabolisme neuronal et astrocytaire de l’APP sont différents et d’autre part, que les neurones représentent une source importante de peptide amyloïde qui entre dans la composition des plaques séniles de la maladie d’Alzheimer

Alzheimer Disease --- Amyloid beta-Protein Precursor --- Medical Laboratory Science --- Neurons

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Accumulation of amyloid β-peptide (Aβ) in the brain is one of the characteristics of Alzheimer’s disease. This peptide is one of the cleavage products resulting from the catabolism of a precursor named Amyloid Precursor Protein (APP). Endoproteolytic cleavages of APP by alpha-, beta- and gamma-secretase activity release soluble APP, Aβ and intracellular Carboxy-terminal domain (AICD).
APP interacts via its C-terminal domain (AICD) with the adaptor protein Fe65. This adaptor protein could have effects on the processing of APP by stabilizing AICD and could play an important role in the AICD-dependent signaling. The aim of this work was to analyze the impact of Fe65 expression on the processing of APP, and more precisely on AICD production.
To that end, we used an APP Gal4 fusion protein to measure AICD release by a Gal4 transactivation assay and we developed a Western blotting techniques for visualizing AICD directly.
The transactivation assays show that AICD was produced by a γ-secretase activity which is presenilin-dependent. The results of Western blotting demonstrated that AICD was degraded by a metalloprotease sensitive to phenontrolin and not by the proteasome. Next, we tested the impact of Fe65 expression on AICD production. Our results point out that Fe65 does not increase the amount of AICD, but has a transcriptional activity independent of the AICD concentration. Moreover, we found that Fe65 reduced extra cellular Aβ production by 32% and this decrease was not a consequence of modified β- or γ-cleavage L’accumulation de peptides amyloïde (Aβ) au niveau cérébral est une caractéristique de la maladie d’Alzheimer. Ce peptide est un des produits de clivage d’un précurseur appelé précurseur du peptide amyloïde (APP). Celui-ci subit des clivages endoprotéolytiques par des activités α-, β- et γ-sécrétases qui conduisent à la production d’ APP soluble, d’Aβ et d’un fragment C-terminal intracellulaire appelé AICD (APP Intra Cellular Domain).
L’APP interagit au niveau de son domaine C-terminal (AICD) avec la protéine adaptatrice Fe65. Cette protéine adaptatrice interviendrait dans le métabolisme de l’APP en stabilisant le fragment AICD. Elle pourrait aussi jouer un rôle dans les voies de signalisation intracellulaires. Le but de ce travail est d’analyser l’effet de l’expression de la protéine Fe65 sur le métabolisme de l’APP, et plus particulièrement sur la production d’AICD.
Pour cela, nous avons, d’une part, utilisé des protéines de fusion APP Gal4 qui permettent de mesurer la libération d’AICD grâce à un test de transactivation et , d’autre part, nous avons mis au point une technique de Western blotting permettant de mettre en évidence directement l’AICD.
Les résultats des tests de transactivation ont montré que l’AICD était effectivement produit par une activité γ-sécrétase préséniline-dépendant. En mettant au point une méthode de Western blotting nous avons démontré que l’AICD était dégradé dans la cellule par une métalloprotéase sensible à la phénonthroline et non par le protéasome. Nous avons ensuite testé l’effet de la surexpression de Fe65 sur la production d’AICD. Nos résultats indiquent que Fe65 n’augmente pas la quantité d’AICD dans la cellule et suggèrent que Fe65 pourrait avoir une activité transcriptionnelle indépendant de la quantité d’AICD présente. De plus, nos données ont permis de mettre en évidence que l’expression de Fe65 diminue de 32% la quantité de peptide amyloïde extracellulaire. Cette diminution n’est pas due à une altération des clivages β ou γ de l’APP

FE65L1 protein, human --- Alzheimer Disease --- Amyloid beta-Protein Precursor

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La maladie d’Alzheimer est une démence dégénérative caractérisée par deux lésions neuropathologiques, les dégénérescences neurofibrillaires et les plaques séniles. Le constituant majeur des dépôts amyloïdes des plaques séniles est un peptide appelé βA4. Il dérive d’un précurseur transmembranaire appelé APP (Amyloid Peptide Precursor). L’étude du métabolisme de l’APP est importante pour comprendre la formation des dépôts amyloïdes de la maladie d’Alzheimer. Dans des modèles cellulaires, deux voies cataboliques de l’APP ont été mises en évidence : la voie non amyloïdogène dans laquelle de l’APP soluble est produit par clivage de la protéine au sein même du peptide βA4, et la voie amyloïdogène donnant naissance au peptide amyloïde.
Des cellules CHO ont été cotransfectées par le plasmide pSVK3 comprenant l’ADNc de l’APP 695 et le plasmide pSV2néo, qui contient un gène de résistance à la néomycine. Un des clones obtenu après sélection au G418, produit dans son milieu de culture, l’APP soluble et du peptide βA4 reconnus par des anticorps spécifiques en immun précipitation.
Dans le but d’étudier le rôle de l’internalisation de l’APP transmembranaire dans la formation du peptide βA4, deux méthodes ont été utilisées pour inhiber l’endocytose dans des puits tapissés de clathirine. D’une part, les cellules transfectées ont été cultivées en absence de K+, ce qui provoque des perturbations au niveau de l’assemblage de la clathirine, empêchant l’internalisation des protéines par endocytose. Dans ces conditions expérimentales, l’internalisation de la transferrine, liée à son récepteur, est fortement diminuée. La privation de k+, si elle ne dépasse pas une heure, n’est pas novice pour les cellules, dont la viabilité a été mesurée par le test MTT. Dans le milieu de culture des cellules marquées à a la S-méthionine, puis privées de K+ pendant une heure, l’APP soluble est immunoprécipité. Par contre, le peptide βA4 n’est pas détecté dans ce milieu de culture.
D’autre part, des cellules CHO ont été co-transfectés de manière stable avec le plasmide pSVnéo et le plasmide pSVK3 comprenant l’ADNc de l’APP 695, délété de la séquence codant le domaine C-terminal intracellulaire. Cette délétion a pour conséquence d’éliminer la séquence en acides aminés NPTY, qui joue probablement un rôle dans l’internalisation de l’APP par endocytose dans des puits tapissés de clathrine. Un clone a été sélectionné au G418. Dans le milieu de culture alors que l’APP soluble est produit en quantité supérieure à ce que produisaient les cellules transfectées par l’ADNc de l’APP 695 complet.
Ces résultats montrent que l’inhibition de l’internalisation empêche la formation de peptide βA4. L’endocytose de l’APP transmembranaire dans des puits tapissés de clathrine est donc impliquée dans la production du peptide amyloïde de la maladie d’Alzheimer.

Alzheimer Disease --- Amyloid beta-Protein Precursor --- CHO Cells