Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

The principal aim of this work was to evaluate the impact of the inhibition of the activation of Ras, using a treatment with S-Farnesylthiosalycilic acid (FTS), on the liver regeneration in rats subjected to a partial hepatectomy (PH).
The firs step was the elaboration of the injection scheme of FTS that blocked the activation of the protein Ras after PH. The scheme that was used finally consisted of three injections of FTS (50mg/kg) 1 hour, 8 hours and 16 hours after PH. The rats were sacrificed 12 or 24 hours after PH. The impact of the FTS treatment, on the liver regeneration, was determined by the expression of PCNA, a cell proliferation marker, as well as the incorporation of BrdU into DNA of hepatocytes during S-phase of the cell cycle and its quantification by flow cytometry analysis. The results confirmed that these injection scheme of FTS provokes a significant reduction of the hepatic regeneration on rats subject to PH.
The next step was to verify, by direct and indirect ways, whether the effect of FTP was due to a functional inhibition of the protein Ras. The direct way was based on the determination, by western-blotting, of the localization of Ras, in the cytosol and/or at the plasma membrane in rats, treated with FTS or DMSO, sacrificed 12 and 24 hours after PH. Unlike DMSO-treated rats, where the Ras protein was only localized to the plasma membrane, the latter was found in both the cytosol and the membranefractions in FTS-treated animals resulting in an inactivation af Ras. The indirect way, determined by western-blotting, was based on the expression, of the phosphorylated forms of three proteins : the protein Rad and the protein Erk1/2 (or P44/p42), by western-blots in rats treated with FTS or DMSO after PH. The protein Raf is a direct target of inactivated Ras (RAS-GTP) which recruits it to the plasma membrane where Raf is phsopharylated and activated by unknown mechanisms. The results showed that the phosphorylated form of Raf was only expressed in the membrane fractions of FTS-treated rats after PH whereas its expression occurred normally in DMSO-treated animals. The proteins Erk1/2 are localized downstream of Raf which controls, in part, their activation. In parallel to what was observed with p-Ras, the expression of the phosphorylated forms of Erk ½ was only reduced in FTS-treated rats but not DMSO-treated animals after PH, confirming the functional inhibition of Ras.
Finally, the last step was to verify that FTS acts primarily on the mature Ras protein and does not affect the expression of its messenger RNA. Amplification of mRNA expression by real time PCR showed a similar increase in Ras mRNA after PH regardless whether the animals were treated with FTS or DMSO, suggesting that FTS does indeed have no impact on the expression of Ras mRNA.
Taken together, these observations confirm that the functional inhibition of Ras, by FTS, results in a significant reduction in liver regeneration which is cumulated with an inhibition of membrane recruitment of Raf and downstream activation of Erk1/2 proteins.
In conclusion, the protein Ras seems to play an important role in liver regeneration possibly implicating, at least in part, the Ras/Raf/MER1.2/Erk1.2 pathway L’objectif principal de ce mémoire est d’évaluer l’impact de l’inhibition de l’activation de Ras sur la génération hépatique chez des rats soumis à une hépatectomie partielle (HP) de 70%.
La première étape a été de mettre au point le schéma d’injection d’un inhibiteur compétitif de Ras, l’acide farnésylthiosalicylique (FTS), permettant d’inhiber l’activation de la protéine Ras. Le schéma utilisé a été de trois injections de 50mg/kg de FTS et réparties comme suit : la première injection une heure après HP, la seconde 8 heure après HP et la troisième 16 heures après HP. Le sacrifice ayant lieu 12 ou 24 heures après HP.
Par mesure de l’expression du PCNA, protéine exprimée durant le cycle cellulaire et donc marqueur de prolifération, et la mesure de la synthèse ADN par immunohistochimie et cytométrie de flux, nous avons confirme que le schéma d’injection utilisé provoque effectivement, une diminution significative de la régénération hépatique en réponse à une hépatectomie partielle.
L’étape suivante a été de vérifier, de façon directe et indirecte, que l’impact du FTS sur la régénération hépatique était bien lié à une inhibition fonctionnelle de Ras. L’évaluation, de manière directe, de l’absence d’activation de Ras, s’est basée sur la visualisation de la localisation, membranaires et cytosoliques, des différents échantillons de foie de rats traités au DMSO (solvant) et au FTS (substance active) après HP, ont été préparées et analysées par Western-blot. Les résultats ont montré que le traitement au FTS, des rats ayant subi une HP, est responsable d’une délocalisation incomplète de la protéine Ras, celle-ci étant exprimée tant au niveau des fractions membranaire que cytosoliques. Cette localisation cytosolique étant d’une inhibition de l’activation de Ras.
L’étape suivante a été d’évaluer, de façon indirecte, l’inhibition fonctionnelle de Ras. L’expression de la forme phosphorylée de la protéine Raf, cible directe de la protéine Ras activée (Ras-GTP), a été évaluée, par western-blot, à partir de fractions membranaires d’hépatocytes de rats traités au DMSO et au FTS, sacrifiés 24 heures après HP. Les autres protéines, dont l’expression des formes phosphorylées ont été évaluées, par western-blot, et quantifiées, après densitométrie, à partir d’homogénats de foies de rats traités au DMSO et au FTS, sacrifiés 12 et 24 heures après HP, sont les protéines Erk1 (p44) et Erk2 (p42). Elles sont situées en aval de la protéine Raf, qui module leur activation par l’intermédiaire des protéines MERK1 et MERK2.
Les résultats obtenus montrent l’absence d’expression de la forme phosphorylée de la protéine Raf, au niveau membranaire, et la diminution de l’’expression des formes phosphorylées des protéines p42/p44, chez les rats traités au FTS après HP. Ces résultats sont donc en accord avec ceux obtenus plus haut et ont permis de confirmer l’existence d’une inhibition fonctionnelle de Ras.
Après avoir montré l’inhibition de l’activation de Ras, il était important de pouvoir confirmer que le FTS agissait bien sur la forme mature de la protéine et non sur l’ARN messager de celle-ci, dont l’expression augmente après HP. L’expression de l’ARN messager de Ras a alors été analysée par PCR quantitative en temps réel. Celle-ci confirme bien l’absence d’atteinte de l’expression de l’ARNm par le FTS.
Les résultats obtenus nous permettent de dire que l’inhibition fonctionnelle de Ras a, pour conséquence première, une diminution significative de la régénération hépatique et que cette réduction est associée à l’absence de recrutement membranaire de la protéine Raf et, plus en aval, à l’inhibition de l’activation de la protéine Erk.
On peut donc conclure que Ras joue un rôle important dans le mécanisme de la régénération hépatique et que ce mécanisme pourrait impliquer la voie Ras/Raf/MERK1,2/Erk1,2

Oncogene Proteins --- Rats --- Hepatectomy --- Liver

Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

NF-kappa B --- Proto-Oncogene Proteins --- DNA Damage --- Transcription Factors

Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

nf-kappa b --- proto-oncogene proteins --- lymphocyte transformation --- t-lymphocytes --- neoplasms --- nf-kappa b --- proto-oncogene proteins --- lymphocyte transformation --- t-lymphocytes --- neoplasms

Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

Les malformations veineuses (VM) sont des défauts localisés qui surviennent lors du développement vasculaire embryonnaire. La majorité des VM sont sporadiques. Dans 50% des cas, elles sont dues à des mutations somatiques dans le gène TEK codant pour le récepteur tyrosine kinase TIE2. TIE2 est exprimé dans les cellules endothéliales vasculaires et joue un rôle important lors de l'angiogenèse. La mutation la plus fréquemment rencontrée chez les patients souffrant de VM sporadique est une substitution d'une leucine en phénylalanine en position 914 (L914F). On retrouve aussi des mutations non-sens qui tronquent la queue C­ terminale de TIE2. Rl 099X, étant le plus proximal de ces changements, est la mutation non­ sens la plus fréquente.Toutes les mutations qui causent des VM induisent une phosphorylation du récepteur TIE2 indépendante du ligand. Dans L914F, cela cause une activation des AKT et STATI jouant un rôle dans la pathogenèse des VM. Nous avons voulu évaluer si R1099X utilise les mêmes voies moléculaires que L914F malgré l'absence de trois tyrosines phosphorylables impliquées précédemment dans leur activation.Nous avons constaté que R1099X, comme L914F, affectent l'activation de AKT et de STATI lorsqu'ils sont surexprimés in vitro. Nous voulions donc déterminer si la queue C-terminal de TIE2 et ses tyrosines, connues pour être importantes dans la signalisation par le récepteur sauvage, participe aussi dans la signalisation de L914F. Nous constatons que l'absence de la queue C-terminale affecte TIE2-WT et L914F différemment , ce qui suggère qu'il y a des différences dans leurs structures. En plus, nous avons trouvé que la régulation de STATl et de AKT par TIE2 est complexe, avec, un équilibre entre l'activation et l'inhibition de ces molécules par le récepteur. Venous malformations (VMs) are localized defects that arise during the development of the vascular system. The vast majority of VMs are sporadic. 50% of sporadic VMs are caused by somatic mutations in the gene TEK, which codes for the endothelial cell tyrosine kinase receptor TIE2. The most common mutation identified in patients is a leucine-to-phenylalanine substitution at position 914 (L914F). Nonsense mutations that cause premature truncation on the inhibitory C-terminal tail domain of TIE2 have also been identified. RI 099X is the most common, as well as the most proximal, of these truncating mutations.All VM-causative mutations induce ligand-independent phosphorylation of TIE2, of varying strengths. In the case of L914F, this causes chronic AKT and STATl activation, linked to disease pathogenesis. We wished to assess whether RI 099X works through the same molecular pathways as L914F despite lacking three phosphorylable tyrosines, previously implicated in their activation.We find that R1099X, like L914F, does indeed affect AKT and STATl activation when overexpressed in vitro. We investigated whether the C-terminal tail and its tyrosines, shown to be important in signaling by wild-type TIE2 upon Angptl ligand-binding , also participates in L914F-signaling. We find that lack of the C-terminal tail affects the wild-type and L914F forms of TIE2 differently, suggesting important differences in their structure. In addition, we find evidence for complex regulation of STATl and AKT by TIE2, with a balance between activation and inhibition of these molecules depending on different C-terminal tail tyrosines.

Arteriovenous Malformations --- Receptor, TIE-2 --- Proto-Oncogene Proteins c-akt --- STAT1 Transcription Factor

Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

Colorectal Neoplasms, Hereditary Nonpolyposis --- DNA-Binding Proteins --- Proto-Oncogene Proteins --- Neoplasm Proteins --- genetics --- epidemiology