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Aminoglycosides are clinical interest antibiotics for patients affected by negative Gram bacteria. Their use is however limited by the nephrotoxic reactions they induce. Megalin, a multiligand receptor, is probably responsible for the uptake of aminoglycosides by the kidney proximal tubular cells and so, for their toxicity.
The main aim of our work is to know better the role and function of megalin in the intracellular transport of aminoglycosides, in connection with their ability to induce toxic phenomenons such as apoptosis, necrosis and phospholipidosis. This knowledge should let us assess methods or drugs treatments able to decrease aminoglycosides nephrotoxicity.
So, our first goal is to determine the way that megalin expression in culture cells modulate significantly gentamicin uptake and toxicity. In his aim, we managed to use renal cells (LLC-PK1) and non-renal cells (BN16), both known to express megalin at variable levels and studied in comparison with non renal cells wich do not express megalin (J774 macrophages and Fibroblasts). The aim is to determine if megalin expression influence cells phospholipidosis and apoptosis induced by gentamicin. In our experimental conditions, the results show no link between this receptor expression with uptake, apoptosis and phospholipidosis.
Using cells wich express megalin differently, our second objective is to compare gentamicin cellular toxicity with geneticin, an aminoglycoside characterized by its effect on eukaryotic cells. We determined necrotic and apoptotic cells levels and also the lysosomial permeability induced by those two antibiotics. The results show us toxicity variability between those two aminoglycosides according to cellular type. A correlation can be made between apoptosis and lysosomial permeability induce by gentamicin, but not with geneticin. Finally, we found an reverse link between necrosis and apoptosis in LLC-PK1 cells, but not in BN16 cells.
A secondary target, was to set up a fast and reliable method in order to quantify cellular aminoglycosides according to our needs. The high performance liquid chromatography paired with an pulsed-electrochemical detection (HPLC-PED) used in our experiments was not able to measure efficiently aminoglycosides amount in our cellular samples after incubation Les aminoglycosides sont des antibiotiques d'intérêt clinique pour les patients atteints d'infections graves à germes Gram-négatif. Leur usage est cependant limité par les réactions néphrotoxiques qu’ils induisent. La mégaline, un récepteur multiligand, est très probablement responsable de la capture préférentielle des aminoglycosides par les cellules tubulaires proximales du rein, et dès lors de leur toxicité.
L’objectif général de notre travail est de mieux connaître le rôle et la fonction de la mégaline dans le transport intracellulaire des aminoglycosides, en relation avec leur capacité à induire des phénomènes toxiques tels que l’apoptose, la nécrose et la phospholipidose. Cette connaissance devrait nous permettre d'évaluer de façon rationnelle des méthodes et/ou traitements médicamenteux susceptibles de diminuer la néphrotoxicité des aminoglycosides.
Ainsi, le premier but que nous nous sommes fixés est de déterminer dans quelle mesure l'expression de la mégaline dans des cellules en culture module de façon significative la capture et la toxicité de la gentamicine (aminoglycosides de référence). A cette fin, nous avons utilisé des cellules rénales (LLC-PK1) et non rénales (BN16) connues pour exprimer, à des taux variables, la mégaline et les avons étudiées en comparaison avec des cellules non-rénales ne l'exprimant pas (macrophages J774 et Fibroblastes). L'objectif est de déterminer si l'expression de la mégaline influence la phospholipidose et l’apoptose induite par la gentamicine. Les résultats obtenus dans nos conditions expérimentales montrent qu’il n’y a pas de lien entre l’expression de ce récepteur et capture, apoptose et phospholipidose.
En utilisant des cellules qui expriment différemment la mégaline (LLC-PK1 et BN16), notre deuxième objectif a été de comparer la toxicité cellulaire de la gentamicine avec la généticine, un aminoglycoside caractérisé par son effet au niveau des cellules eucaryotes. Nous avons déterminé le taux de cellules apoptotiques et nécrotiques, ainsi que le degré de perméabilité lysosomiale induite par ces deux antibiotiques. Les résultats obtenus nous montrent une variabilité de la toxicité de ces deux aminoglycosides selon le type cellulaire. Une corrélation peut être établie entre l’apoptose et la perméabilité lysosomiale induite par la gentamicine, mais pas avec la généticine. D’autre part, nous avons pu établir un lien inverse entre nécrose et apoptose dans les LLC-PK1, mais pas dans les BN16.
Un objectif secondaire était de mettre au point une méthode rapide et fiable de détection des aminoglycosides cellulaires adaptée à nos besoins. La chromatographie liquide à haute performance couplée à un ampéromètre (HPLC-PED) utilisée dans nos expériences n’a pas permis de doser efficacement la quantité d’aminoglycosides présents dans nos échantillons cellulaires après incubation

Aminoglycosides --- Low Density Lipoprotein Receptor-Related Protein 2 --- Gram-Negative Bacterial Infections --- Gentamicins