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Glycolysis --- Metabolism

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Like in other tissues, heart glycolysis is regulated by substrates supply, energy demand and hormones such as insulin. The stimulation of heart glycolysis by insulin implies the activation of 6-phosphofructo-2-kinase (PFK-2), the enzyme responsible for the synthesis of fructose-2,6-bisphosphate. This compound is a potent allosteric activator of 6-phosphofructo-1-kinase, a key glycolytic enzyme. Previous work from the laboratory has demonstrated that a lipid-kinase, the phosphoinositol-3 kinase (PI3-kinase), is involved in the activation of heart PFK-2 by insulin. PI3-kinase is known to activate different protein-kinases such protein-kinase B and p70 ribosomal protein S6 kinase (p70S6K). However, these different protein-kinases are not implicated in the activation of heart PFK-2 by insulin, as demonstrated recently in the laboratory. Therefore, another insulin-sensitive protein-kinases was partially purified. This protein-kinase is able to phosphorylate and activate heart PFK-2 “in vitro” and has been called WISK for wortmannin-sensitive and insulin stimulated protein-kinase.
The aim of this work was to improve the purification protocol of WISK to allow its identification. To reach these objectives, we have adapted the methodology to increase the yield by using hearts from different species. In addition, we have introduced new purification steps. The use of rabbit hearts treated by insulin and chromatographic purification on protamine-agarose and phenyl-superose led to the purification of two different protein-kinases, originally present in WISK. The first, slightly insulino-sensitive, is related to the family of p-21 activated protein-kinase. The second, strongly insulino-sensitive, is not yet identified, but is probably a protein-kinase associated to heat shock protein. Both are able to phosphorylate and activate heart PFK-2 in vitro. La glycolyse du cœur, comme celle d’autres tissus, est soumise à un contrôle par l’apport de substrats, la demande énergétique et par des hormones telles que l’insuline. La stimulation de la glycolyse cardiaque par l’insuline implique l’activation de la 6-phosphofructo-2-kinase (PFK-2), l’enzyme responsable de la synthèse de fructose-2,6-bisphosphate. Ce composé est un activateur allostérique puissant de la 6-phosphofructo-1-kinase, une enzyme clef de la glycolyse. Les travaux antérieurs du laboratoire d’accueil ont mis en évidence l’implication d’une lipide-kinase, la phosphoinositol-3-kinase (PI3-kinase), dans l’activation de la PFK-2 cardiaque par l’insuline. La PI3-kinase permet l’activation de différentes protéine-kinases, telles que la protéine-kinase B (PKB) et la protéine-kinase de 70 kDa phosphorylant la sous-unité S6 du ribosome (p70S6K). Cependant, ces différentes protéine-kinases ne sont pas nécessaires à l’activation de la PFK-2 cardiaque par l’insuline, ainsi que l’ont montré les travaux récents du laboratoire. Par conséquent, une autre protéine-kinase insulino-sensible a été recherchée et partiellement purifiée. Cette protéine-kinase est capable de phosphoryler et d’activer la PFK-2 cardiaque « in vitro », elle est appelée WISK (wortmannin-sensitive and insulin stimulated protein-kinase).
Le travail expérimental présenté dans ce mémoire visait à améliorer le protocole de purification de WISK en vue de son identification. Pour atteindre ces objectifs, nous avons dû adapter la méthode afin d’obtenir suffisamment de matériel, et nous avons utilisé et comparé des cœurs provenant d’espèces différentes. Nous avons, de plus, introduit de nouvelles étapes de purification. L’utilisation de cœurs de lapin traités à l’insuline et de chromatographies sur protamine-agarose et phényl-superose ont abouti à la purification de deux « PFK-2 kinases », qui étaient présentes dans la préparation originale de WISK. La première, légèrement insulino-sensible, fait partie de la famille des p21-activated kinases (PAK). La seconde, fortement insulino-sensible, doit encore être identifiée, mais est probablement une protéine-kinase associée aux protéines de choc thermique (HSP). Toutes deux sont capables de phosphoryler et d’activer la PFK-2 cardiaque in vitro

Glycolysis --- Heart --- Insulin

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The development of cancer is a multistep evolutionary process. At each step, cells are submitted to a selective pressure. With a Darwinian dynamic, cells which develop a phenotype adapted to their environment are able to survive. Without adaptation, the majority of human tumors stays in a quiescent state, resulting from a balance between cell proliferation and death. Unbridled proliferation of tumor cells progressive/y creates hypoxic areas distant from functional blood vessels. To grow in this hostile environment, cancer cells undergo two essential adaptations: the "glycolytic switch ", which allows cells to produce energy in a hypoxic environment, and the "angiogenic switch "promoting the development of their own vascular network. In this study, we show that the "glycolytic switch" plays a central role in the angiogenesis process. In particular, we document that lactate, the end product of glycolysis, is a pro-angiogenic agent. Characterization of this pathway has led to discover a new therapeutic approach. Because the uptake of exogenous lactate by the cells requires the transporter MCTJ at the cell membrane, MCTJ inhibition allows to repress angiogenesis and to black tumor growth. Le développement d'un cancer est un processus évolutif comprenant plusieurs étapes. A chaque étape, les cellules sont soumises à une pression de sélection. Par une dynamique Darwinienne, les cellules qui développent un phénotype adapté à leur milieu sont capables de survivre. En absence d'adaptation, la majorité des tumeurs humaines persiste dans un stade de dormance, résultat d'un équilibre entre prolifération et mort cellulaire. La prolifération débridée des cellules cancéreuses génère progressivement des zones tumorales hypoxiques, éloignées de vaisseaux sanguins fonctionnels. Pour survivre à cet environnement hostile, les cellules cancéreuses procèdent à deux adaptations essentielles: le switch glycolytique qui permet de produire de l'énergie en absence d'oxygène et le switch angiogénique qui permet la néovascularisation du tissu. Dans cette étude, nous montrons que le switch glycolytique joue un rôle majeur dans le développement de l'angiogenèse tumorale. En particulier, nous documentons que le lactate, produit final de la glycolyse, est un agent pro-angiogénique . La caractérisation de cette voie signalétique a permis d'élaborer une nouvelle approche thérapeutique. Puisque l'entrée du lactate exogène dans la cellule requiert le transporteur membranaire MCTl, l'inhibition de ce transporteur permet de réprimer l'angiogenèse et de bloquer la croissance tumorale.

Glycolysis --- Angiogenesis Inducing Agents

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Glycolipids --- Glycolysis --- transport across biological membranes

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B-cell chronic lymphocytic leukemia (B-CLL) is the most common form of adult leukemia on the Western world. B-CLL is characterized by the accumulation of mature B lymphocytes, which is explained mainly by a decreased cell mortality due to defect(s) in apoptotic cell death. Therapeutics approaches include corticosteroids, alkylating agents, nucleoside analogues or monoclonal antibodies, alone or in combination. Although these treatments are active, B-CLL remains an incurable disease, because of emergence of resistance. The laboratory where I performed my suited is particularly interested in the mechanisms of action of nucleoside analogues, aiming at improving their clinical efficacy.
My work has been initiated by the observation of a member of the team, L. Bastin-Coyette. He demonstrated that the lymphotoxicity of 2-chloroadenosine (an agonist of adenosine, not used in therapy) was due, at least partly, to a decrease in intracellular ATP. As the nucleoside analogues used to treat B-CLL, 2-chlorordeoxyadenosine (CdA) and fludarabine, have no significant effect on ATP concentration, we wondered whether their efficacy could be enhanced by combining them with compounds that induce a depletion in ATP. Hence, we tested the effect of glycolysis inhibitors: 2-deoxyclucose (2DG), 2-fluorodeoxyglucose (2FG) and 3-bromopyruvate (3BrPA). We have shown that these three inhibitors were able to inhibit (by more than 80%) glycolysis in leukemic cells. However, ATP reduction and cytotoxicity varied according to the inhibitor.
Next, we combined the different glycolysis inhibitors with CdA or fludarabine and we analyzed the cytotoxicity induced by these combinations. The combination of 2DG, and in a lesser extent, of 3BrPA with nucleoside analogues induced synergic cytotoxicity, suggesting that combination of these compounds with CdA or fludarabine could interesting to treat B-CLL. Conversely, 2FG, yet the most specific glycolysis inhibitor, tended to antagonize the cytotoxicity of nucleoside analogues. This last result suggests that glycolysis inhibition alone cannot explain the synergy observed with 2DG and 3BrPA. Probably other targets have been reached by 2DG and 3BrPA, which allow improving efficacy of nucleoside analogues.
Finally, we investigated the mechanisms of cytotoxicity of glycolysis inhibitors in leukemic cells. We examined whether they induced apoptosis (activation of caspace-3, clivage PARP) and searched whether their cytotoxicity could be counteracted by some means ‘addition of mannose, antioxydants, …). It appeared that the mechanisms of cytotoxicity are different for the three inhibitors, and that their cytotoxicity is not only due to glycolysis inhibition La leucémie lymphoïde chronique de type B (LLC-B) est la plus fréquente des leucémies de l’adulte en Occident. Elle est caractérisée par une accumulation de lymphocytes B matures quiescents qui s’explique principalement par leur résistance à l mort par apoptose. Le traitement consiste en l’administration de cortico-stéroïdes, d’agents alkylants, d’analogues de nucléosides ou d’anticorps monoclonaux, seuls ou en association. Malgré leur efficacité, ces traitements ne peuvent cependant pas guérir les malades. Des résistances apparaissent, soit d’emblée, soit au fil des traitements. Mon laboratoire d’accueil s’intéresse particulièrement au mode d’action des analogues de nucléosides et recherche des stratégies qui permettraient de renforcer leur efficacité.
Mon travail résulte de l’observation d’un chercher de l’équipe, L. Bastin-Coyette, qui a démontré que la lymphotoxicité de la 2-chloroadénosine (un agoniste de l’adénosine non utilisé en clinique) était due en partie à la chute d’ATP qu’il induisait. Comme les analogues de nucléosides utilisés en clinique, la 2-chlorodésocyadénosine (CdA) et la fludarabine, n’ont pas ou peu d’effet sur la concentration d’ATP, nous nous sommes demandé s’il serait possible de renforcer leur efficacité thérapeutique en les combinant à des agents qui font baisser l’ATP. Dans ce but, nous avons testé l’effet d’inhibiteurs de la glycolyse : le 2-désoxyglucose (2DG), le 2-fluorodésoxyglucose (2FG), et le 3-bromopyruvate (3BrPA). Nous avons pu démontrer que ces trois composés inhibaient effectivement la glycolyse dans les cellules leucémiques, mais que la chute d’ATP ainsi que la cytotoxicité qu’ils induisaient variait selon l’inhibiteur utilisé.
Dans une seconde étape, nous avons combiné ces trois inhibiteurs de la glycolyse avec la CdA ou à la fludarabine et analysé la cytotoxicité de ces combinaisons. L’association du 2DG, et dans une moindre mesure du 3BrPA, aux analogues de nucléosides produisait une cytotoxicité synergique dans les cellules de type LLC-B, suggérant que la combinaison de ces inhibiteurs de la glycolyse avec la fludarabine our la CdA pourrait être une thérapie avantageuse pour lutter contre la LLC-B. Au contraire, le 2FG, qui était l’inhibiteur le plus spécifique de la glycolyse, avait plutôt tendance à antagoniser leurs effets. Ce dernier résultat suggère que ce n’est pas l’inhibition de la glycolyse qui potentialise les effets des analogues de nucléosides et que les effets bénéfiques observés en présence de 2DG et 3BrPA résulteraient de l’atteinte d’autres cibles.
Finalement, nous avons investigué les mécanismes de cytotoxicité des inhibiteurs de la glycolyse dans les cellules leucémiques. Nous avons examiné s’ils induisaient de l’apoptose (activation de la caspace-3, clivagede PARP) et recherché s’il existait des moyens de contrecarrer leur cytotoxicité ‘addition de mannose, d’antioxydants, …). Il est apparu que ces trois inhibiteurs agissaient de façon différents, indiquant que leur cytotoxicité n’est pas seulement due à leur capacité d’inhiber la glycolyse

Glycolysis --- Nucleosides --- Leukemia, Lymphocytic, Chronic, B-Cell