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La membrane biologique a longtemps été considérée comme une mosaïque fluide et homogène. Cependant, ce modèle a été remis une première fois en question suite à la découverte des «rafts», ces radeaux nanométriques instables enrichis en cholestérol et sphingomyéline et initialement définis comme des DRMs («Detergent-Resistant Membranes ») suite à leur résistance à la solubilisation par des détergents non-ioniques à 4°C. La découverte plus récente par le laboratoired'accueil de domaines submicrométriques apporte une seconde révision au modèle de Singer­Nicolson. Ces domaines, plus larges (µm vs nm) et plus stables (min vs sec) que les rafts, ont été observés grâce à l'insertion dans la membrane plasmique de globules rouges d'analogues fluorescents de lipides polaires (BODIPY-sphingomyéline et -phosphatidylcholine) et au marquage direct de la sphingomyéline et di cholestérol endogènes par des fragments fluorescents de toxines spécifiques (lysénine* et theta* respectivement). Mon mémoire s'intéresse à la biogénèse de domaines submicrométriques enrichis en cholestérol et à leur relation avec les rafts.J’ai d’abord étudié la biogenèse des domaines submicrométriques enrichis en cholestérol par microscopie vitale confocale. Ces domaines disparaissent suite à une déplétion de ~ 30% en sphingomyéline, ce qui suggère que ce sphingolipide joue un rôle clé dans leur biogenèse. Ils dépendent aussi la température, de la tension membranaire et de l’ancrage de la membrane au cytosquelette sous-jacent. J’ai ensuite examiné leur relation spatiale dans les domaines enrichis en lipides polaires : une co-localisation importante a été observée avec la BODIPY-sphingomyéline comme attendu, mais aussi avec la –phosphatidylvholine (un phospholipide non-enrichi dans les rafts), suggérant que les domaines submicrométriques ne résultent pas simplement du rassemblement de rafts nanométriques. J’ai ensuite recherché si le cholestérol était également enrichi dans les rafts nanométriques. Malgré un avancement dans les mises au point, je n’ai pas pu exploiter la microscopie électronique pour étudier cette question. J’ai donc développé la technique des DRMS isolés sur des gradients de sucrose. J’ai ainsi confirmé l’existence de rafts à la surface des globules rouges et ai estimé leur enrichissement en cholestérol en comparaison avec les fractions non-rafts (dot blots). Une déplétion en cholestérol de ~35% entraine la redistribution totale des protéines spécifiques des rafts vers les fractions non-rafts. J’ai également commencé à explorer la relation éventuelle entre les domaines submicrométriques et les rafts. Pour ce faire, des DRMS ont été préparés à partir de globules rouges déplétés en sphingomyéline. Une déplétion de ~30% induit la disparition des domaines submicrométriques enrichis en cholestérol mais n’affecte pas l’association de protéines spécifiques aux rafts, ce qui suggère à nouveau que ces deux types de domaines sont distincts. En conclusion, les données obtenues au cours de ce mémoire ont permis de montrer que les domaines submicrométriques enrichis en cholestérol (i) sont favorisés par la sphingomyéline et restreints par l’ancrage de la membrane au cytosquelette ; (ii) ne résultent pas simplement du rassemblement de rafts, mais (iii) coexistent plutôt avec ceux-ci à la surface des globules rouges. The biological membrane has been considered for a long time as a fluid and homogenous mosaic (the model of Singer and N1colson) .This model has however been questioned following the discovery of transient nanometric lipids rafts enriched in cholesterol and sphingolipids. These rafts were initially defined as DRMs (Detergent-Resistant-Membranes) due to their resistance to solubilization by non-ionic detergents at 4°C. The recent discovery by the host laboratory of stable submicrometric lipid domains at the surface of various cell types provides a second revision to the fluid mosaic model. These domains, which are larger (µm vs nm) and more stable (min vs sec) than rafts, have first been observed thanks to the insertion of fluorescent analogs of polar lipids (BODIPY­ sphingomyel in and -phosphatitylcholine) in the plasma membrane of living red blood cells. Endogenous sphingomyelin and cholesterol have next been directly labeled by fluorescent fragments of specific toxins (Lysenine• and Theta•, respectively) . During my master thesis, I studied the biogenesis of cholesterol-enriched submicrometric domains and their relationship with nanometric rafts.I first used confocal vital imaging to investigate the biogenesis of cholesterol-enriched submicrometric domains. Thanks to this technique, I observed that a -30% depletion of sphingomyelin leads to the disappearance of cholesterol-enriched domains, suggesting a crucial role of this sphingolipid in their biogenesis. Cholesterol domains are also governed by temperature, membrane tension and membrane anchorage to the underlying cytoskeleton. 1 next focused on the spatial relationship between these domains and the polar lipid-enriched submicrometric domains. My findings showed, as expected, a co-localization between the cholesterol-enriched and the BODIPY-sphingomyelin-enriched domains, but also with BODIPY-phosphatidylcholine domains.Since phosphatidylcholine is not enriched in rafts, these results suggest that submicrometric domains do not simply result from the clustering of lipid rafts. I then started studying nanometric rafts and looked for their enrichment in cholesterol. Despite numerous improvements, electron microscopy remained inapplicable for this study. This is why 1 developed a method to isolate DRMs on sucrose flotation gradients. This technique allowed me to confirm the existence of nanometric rafts at the plasma membrane of red blood cells and to estimate their enrichment in cholesterol in comparison with non-rafts fractions. 1 also found that a -35% cholesterol depletion leads to a global redistribution of raft proteins to non-raft fractions, which confirms that cholesterol plays a central role inthe maintenance of lipid rafts.The last part of my master thesis was dedicated to the investigation of the relationship between submicrometric domains and rafts. To this aim, 1 isolated DRMs from sphingomyelin­ depleted red blood cells. A -30% depletion leads to the disappearance of cholesterol-enriched submicrometric domains, but has nearly no effects on the association of specific proteins to rafts. This finding supports the hypothesis that these two domains are distinct.ln conclusion, this master thes is has allowed to show that cholesterol-enriched submicrometric domains:{i) are favored by sphingomyelin and restricted by membrane anchorage to the underlying cytoskeleton;{ii) do not result from raft clustering;(iii) but rather coexist with them at the surface of red blood cells.

Cholesterol

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Een kwart van de Belgische 40-plussers neemt statines om het cholesterolgehalte te verlagen. Na een hart- of vaatprobleem (hartaanval, beroerte) bieden statines een duidelijk voordeel. Dit voordeel is echter minder groot bij mensen die dit probleem nog nooit hadden. Bovendien kunnen de geneesmiddelen voor aanzienlijke bijwerkingen zorgen. Daarom moeten hun voor- en nadelen goed tegen elkaar worden afgewogen, vooraleer ze voor te schrijven. Het Federaal Kenniscentrum voor de Gezondheidszorg (KCE) ontwikkelde een interactief hulpmiddel om na te gaan wat hun voordelen en risico's bij een individuele persoon zouden zijn. De tool is in de eerste plaats bedoeld voor huisartsen, om tijdens de consultatie met de patiënt te gebruiken en samen een keuze te maken.

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Cholesterol. --- Cholestérol.

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Cholesterol brought by meat-based food favors the development of cardiovascular diseases. At the cellular level, its metabolism is finely regulated by several enzymes which act to maintain its concentration at a constant level. Some drugs, like azythromycin, are able to perturb this metabolism. Azythromycin is a macrolide antibiotic, characterized by an exceptional capacity to accumulate in the lysosomes. In the present work, we therefore used azythromycin as a tool to understand how the cells react to an external perturbation of their metabolism
Our study showed that azythromycin causes the accumulation of cholesterol and phospholipids in rat fibroblasts and human skin fibroblasts. These phenomena took a long time to develop (24 hours). Focusing on cholesterol, we observed that its accumulation depends on the concentration of azythromycin and on the time of exposure origin because its concentration didn’t increase if cells were incubated in a medium containing non LDL.
examining then cellular fate of LDL, we studied the effect of agents known to perturb the cellular metabolism of cholesterol. Heparin (inhibitor of LDL uptake), progesterone (inhibitor of cholesterol intracellular trafficking), chloroquine (inhibitor of cholesterol ester hydrolysis) did not change the cellular level of total cholesterol, but prevented azythromycin effects on cholesterol accumulation. All three agents also decreased the cellular accumulation of azythromycin, making the results difficult to interprete. This study opens perspectives for the exploration of the mechanism by which azythromycin causes an accumulation of cholesterol from exogenous origin in fibroblasts Le cholestérol, apporté par les aliments carnés, est une facture favorisant le développement de pathologies cardiovasculaires. Au niveau cellulaire, son métabolisme est finement régulé par un ensemble d’enzymes pour maintenir sa concentration à un niveau constant. Certains médicaments sont capables de perturber ce métabolisme, parmi lesquels se trouve l’azithromycine. Il s’agit d’un antibiotique appartenant à la famille des macrolides qui présente la particularité de s’accumuler fortement dans les lysosomes. Nous avons donc utilisé ici l’azithromycine pour mieux comprendre comment la cellule réagit à une perturbation extérieure de son métabolisme.
Notre étude a montré que cette molécule induit une surcharge en cholestérol et en phospholipides dans les fibroblastes d’embryon de rat et dans les fibroblastes de peau humaine. Ces phénomènes prennent du temps pour s’installer (24 heures). Nous focalisant sur le cholestérol, nous avons montré que cette surcharge se développait de façon dose et temps dépendante. Nous avons aussi proposé que le cholestérol accumulé était d’origine exogène dans la mesure où l’azithromycine n’induit plus de surcharge si les cellules sont incubées dans un milieu dépourvu de lipoprotéines.
Nous penchant donc sur le devenir cellulaire des LDL, nous avons envisagé l’effet d’agents pharmacologiques connus pour perturber le devenir des LDL ) différents niveaux. L’héparine (inhibiteur de la capture des LDL), la progestérone (inhibiteur de leur trafic) et la chloroquine (inhibiteur de leur dégradation) ne changent pas la taux cellulaire en cholestérol total, mais préviennent les effets de l’azithromycine sur le surcharge en cholestérol. Toutefois, ces trois agents diminuent la concentration cellulaire en azithromycine ce qui rend difficile l’interprétation des résultats. Ce travail ouvre des perspectives vers l’exploration du mécanisme par lequel l’azithromycine induit une surcharge de cholestérol d’origine exogène

Cholesterol --- Azithromycin