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Cell Membrane Permeability

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Myocardium --- Cell Membrane Permeability

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The plasma membrane bears labile microdomains, enriched in colesterol and spingolipids such as sphingomyelin (SM) and glucosylceramide (GlcCer), ad referred to as “rafts”. Occurrence of rafts at endosomes suggests that they undergo endocytosis. However, it is unclear whether the various raft constituents are internalized and traffick in the cell together (“bulk flow model”) or are processed differentially. I first validated the use of two fluorescent (BODIPY) analogs of SM and GlcCer for a quantitative analysis of endocytosis, based on (i) lack of signal saturation upon insertion at the plasma membrane at 4°C; (ii) block of entry at 4°C but efficient internalization at 37°C;and (iii) integrity fter internalization. The kinetics of endocytosis of BODIPY-GlcCer (˜4.5%/min) and BODIPY-SM (˜ 2.5%/min) were (i) surprising faster than expected for markers of poorly mobile domains; and (ii) clearly different from one another, pointing to the existence of distinct raft domains at the cell surface. Steady-state level, kinetics of recycling and subcellular localization by confocal microscopy were also clearly different, extending the notion of raft heterogeneity to endosomes. To test for a role of lipid raft organization in the endocytic processing of these two derivatives, the plasma membrane was depleted in cholesterol by methyl-β-cyclodextrin extraction, or in SM by sphingomyelinase surface digestion. Endocytosis of BODIPY-GlcCer was unaffected, but that of BODIPY-SM was strongly delayed upon cholesterol depletion and strongly accelerated upon SM depletion, indicationg that SM forms unique microdomains stabilized by cholesterol and by concentration of SM. Taken together, these results point to the existence of distinct and heterogeneous lipid rafts, with different en GlcCer and SM, and distinct endocytic fate, strongly arguing against the “bulk flow model”. La membrane plasmique comporte des microdomaines labiles, appelés “radeaux lipidiques” (ou “rafts”) enrichis en cholesterol et sphingolipides tells que la shingomyéline (SM) et la glucosylcéramide (GlcCer). On trouve aussi de tels radeaux lipidiques au niveau des endosomes, ce qui suggère leur participation à l’endocytose. On ne sait toutefois pas si les divers constituants de ces radeaux sont endocytés et progressent ensemble dans l’appareil endocytaire (modèle « bulk-flow ») ou sont traité de manière distincte. J’ai validé deux analogues fluorescents (BODIPU) de la SM et du GlcCer pour une étude quantitative de l’endocytose en démontrant (i) l’absence de saturation du signal après insertion dans la membrane plasmique à 4°C ; (ii) le blocage complet de leur internalisation à 4°C, contrastant avec une endocytose très efficace à 37°C ; et (iii) leur intégrité après internalisation. Les cinétiques d’endocytose du BODIPY-GlcCer (˜4.5%/min) et du BODIPY-SM (˜ 2.5%/min) sont (i) étonnamment plus rapides qu’attendues pour des marqueurs de domaines peu mobiles et (ii) clairement distinctes l’une et l’autre, suggérant l’existence de domaine « rafts » distincts à la membrane plasmique. Les niveaux d’accumulation à l’équilibre, les cinétiques de recylcage, et la localisation subcellulaire en microscopie confocale sont aussi nettement différents, étendant la notion d’hétérogénéité des « raft » aux endosomes. Pour évaluer le rôle de l’organisation en « radeaux lipidiques » sur le processing endocytaire des deux dérivés, la membrane plasmique a été déplétée en cholestérol par extraction à la méthyl-β-cyclodextrine ou en SM par digestion de surface à la shingomyélinase. Ces traitements n’ont pas d’effet sur l’endocytose du BODIPY-GlcCer, mais celle du BODIPY-SM a été fortement retardée par déplétion du cholestérol et fortement accélérée par déplétion en SM, indiquant que la SM forme des microdomaines particuliers, stabilisés par le cholestérol et par une haute concentration en SM. L’ensemble de ces résultats suggère l’existence de radeaux lipidiques distincts, différant dans leur enrichissement en GlcCer et en SM et dans leur sort intracellulaire, ce qui plaide fortement contre le modèle « bulk-flow »

Sphingolipids --- Glycérophospholipids --- Cell Membrane Permeability

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BIOLOGICAL TRANSPORT --- CELL MEMBRANE PERMEABILITY

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Cell Membrane Permeability --- Ion Exchange