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Gentamicin is an aminoglycoside antibiotic which accumulates by endocytosis in the lysosomes of the proximal tubular cells of the kidney and induces apoptosis (El Mouedden et al. 2000, Antimicrob. Chemother Agents; 44:6665-675). This process, depending on the gentamicin concentration, was reproduced on renal cells like LL-C PK1 (El Mouedden et al. 2000, Toxicol. Sci. 56:229-239).
Inside lysosomes, iron could form with gentamicin a complex able to oxydise the lipids or to take part involved in the formation of free radicals. These processes could be responsible for the permeabilisation of the lysosomal membrane, an event susceptible to activate mitochondria and pro-caspase 3 (Servais et al submitted).
The objective of this work was to determine if deferoxamine, a chelator of iron which accumulates preferentially in the lysosomes, could decrease the cellular toxicity induced by gentalin on LLC-PK1 cells as well as the number of cells in apoptosis
These two parameters have been investigated by following the release of lactase deshydrogenase and by counting the number of apoptotic cells after coloration with the DAPI, a known fluorescent marker which intercales in the DNA.
The results indicate a partial protective effect of the deferoxamine when cells are preincubated for 1h or 3h with deferoxamine 25μM and when the iron chelator is maintained for all the duration of incubation with gentamicin (2mM). This partial protective effect probably does not result from a modification of the accumulation of gentamicin. The conditions of use of the deferoxamine must however be strictly controlled due to its own cytotoxic and apoptotic effect.
The mechanisms involved in the protective effect of the deferoxamine apoptosis induced by gentamicin have to be further explored. The deferoxamine would prevent the destabilization of the lysosomial membrane following the formation of the gentamicin/iron-complex or the direct generation of oxygenated radicals, then preventing the release within the cytosol of lysosomal proteases and/or gentamicin, that would then activate mitochondria and the cascade of caspases

Gentamicins --- Deferoxamine --- Aminoglycosides --- Apoptosis

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Aminoglycosides are used in the clinics for the treatment of life-threatening infections by Gram-negative bacteria. Unfortunately, their use is limited by the development of nephrotoxicity in 10% of patients.
In this context, the search for early toxicity markers or for tests able to foresee the toxicity of new molecules in development is of great interest.
At therapeutic concentrations, the aminoglycoside gentamicin induces apoptosis in vivo in the kidneys of treated rats. Comparative studies revealed a parallelism between the extent of apoptosis and the toxicological potency for several aminoglycosides of different toxicity. No equivalent comparative study has been performed in vitro in cultured cells so far.
In this work, we have incubated both renal (LLC-PK1) and non renal (J774 macrophages) cells with two aminoglycosides presenting distinct nephrotoxicity, namely gentamicin and amikacin (gentamicin > amikacin).
We have determined the importance of drug-induced apoptosis in the two selected models (by DAPI staining and caspase-3 assay [an enzyme known to be implicated in the apoptotic process]). To try to understand the underlying mechanism of induced apoptosis, we have studied the aminoglycoside accumulation (microbiological assay), and the potential role of cytosolic aminoglycosides (electroporation). Finally, we have examined the potential occurrence of lysosomal permeabilisation and/or mitochondrial activation.
Our results show a significant difference between the number of apoptotic cells upon exposure to gentamicin or amikacin. Systematically, and irrespective to the cell type used (LLC-PK1 or J774 macrophages), the incubation time, or the aminoglycoside concentration, the number of apoptotic cells was higher in gentamicin-treated cells as compared to amikacin-treated cells, suggesting a correlation between the in vitro induction of apoptosis and the development of in vivo nephrotoxicity.
Considering now the mechanism implicated in the development of aminoglycoside-induced apoptosis, our électroporation studies and our determination of the aminoglycoside cellular accumulation showed a preponderant role of the cytosolic localization of the aminoglycosides. Nevertheless, the intrinsic ability of aminoglycosides to activate the mitochondria (cytochrome c release) and/or the caspase-3 are probably important parameters that should also be taken into consideration. Les aminoglycosides sont utilisés en clinique pour le traitement d’infections sévères par des bactéries à Gram négatif. Malheureusement, leur usage s’accompagne d’une néphrotoxicité qui touche près de 10% des patients.
Dans ce cadre, la recherche de marqueurs précoces de toxicité ou de tests permettant de prévoir la toxicité de nouvelles molécules en développement est d’un grand intérêt.
A doses thérapeutiques, la gentamicine, un antibiotique de la famille des aminoglycosides, induit de l’apoptose in vivo dans les reins de rats traités, et un parallélisme a pu être établi entre l’importance de l’apoptose induite et la toxicité observée en clinique pour plusieurs aminoglycosides de toxicité différente. Aucune étude comparative entre aminoglycosides de toxicité différente n’a encore été réalisée in vitro, sur des modèles de cellules en culture.
Dans ce travail, nous avons incubé des cellules rénales (LLC-PK1) et non rénales (macrophages J774) avec deux aminoglycosides de potentiel néphrotoxique différent, la gentamicine et l’amikacine (gentamicine > amikacine).
Nous avons déterminé l’importance de l’apoptose induite par les antibiotiques sur les deux types cellulaires (par marquage au DAPI et dosage de l’activité de la caspase-3, une enzyme clé dans le processus apoptotique). Afin d’étudier le mécanisme sous-jacent, nous nous sommes intéressés à l’accumulation des aminoglycosides dans les cellules (dosage microbiologique) et au rôle des aminoglycosides présents au sein du cytosol (techniques d’électroporation). Enfin, nous avons recherché une éventuelle perméabilisation lysosomiale et/ou une activation de la mitochondrie.
Nos résultats montrent une différence significative entre le nombre de cellules en apoptose lorsque celles-ci sont incubées avec la gentamicine ou l’amikacine. De façon systématique, quel que soit le type cellulaire (LLC-PK1 ou macrophages J774), le temps d’incubation ou la concentration utilisée, le nombre de cellules en apoptose est plus important avec la gentamicine qu’avec l’amikacine, suggérant qu’un parallèle peut être établi entre l’apoptose observée sur cellules en culture et le développement de réactions néphrotoxiques in vivo.
D’un point de vue du mécanisme qui est impliqué dans le développement de réactions apoptotiques induites par les aminoglycosides, nos études d’électroporation et d’accumulation cellulaire montrent que si l’aminoglycoside présent dans le compartiment cytosolique joue un rôle majeur, sa capacité intrinsèque à activer la mitochondrie (libération du cytochrome c) et/ou la caspase-3 est probablement un paramètre important à prendre également en compte.

Apoptosis --- Aminoglycosides --- Gentamicins --- Amikacin

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Aminoglycosides --- Administration and dosage

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Anthracyclines drugs are used as a treatment regime to combat cancer owing to their great chemotherapeutic potential. They are characterized by the presence of a wide range of derivatives, the most famous are doxorubicin and daunorubicin. The proposed action mechanism of anthracyclines and their derivatives to exert cytotoxic effect involves the intercalation of the drug molecule into nucleic acid and inhibition of the activity of topoisomerases. These events consequences in halting DNA replication and transcription mechanisms of the cell. Understanding of the structural and conformational changes associated with nucleic acid after binding with drugs provides significant knowledge for the development of more effective drugs. A comprehensive elucidation of the molecular mechanism(s) of action of anthracyclines drugs plays a significant role in the rational drug designing to obtain an effective, selective, and safe anti-cancer drugs.

Anthracyclines. --- Aminoglycosides --- Antineoplastic antibiotics --- Polycyclic compounds

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Les nombreuses recherches réalisées ces dernières années sur les mécanismes moléculaires et cellulaires qui conduisent à la néphrotoxicité des aminoglycosides ont permis, en 1989, de proposer l’hypothèse suivante : les aminoglyccosides, en seliant aux phospholipides acides inclus dans les liposomes, diminueraient la charge négative portée par les bicouches lipidiques indispensable à l’activité optimale des phospholipases lysosomiales vis-à-vis de la phosphatidylcholine
Cette hypothèse simple a cependant dû être modulée suite aux résultats de travaux ultérieurs sur l’effet de la nature du phospholipide acide inclus dans la bicouche sur l’activité des phospholipases lysosomiales vis-à-vis de la phosphatidylcholine et leur inhibition par les aminoglycosides. En affet, l’hydrolyse de la phosphatidylcholine est d’autant plus importante que les liposomes contiennent comme phospholipide acide de l’acide phosphatidique, de la phosphatidylsérine ou du phosphatidylinositol. Par ailleurs, alors que par filtration sur gel (Wagner, 1987) ou par équilibre de dialyse (Piret, 1989), les paramètres de liaison (Kd et Bmax) de la gentamicine à des liposomes chargés négativement apparaissent semblables quelque soit la nature du phospholipide acide inclus dans les bicouches, la gentamicine exerce un effet inhibiteur nettement moindre sur l’activité des phospholipases lysosomiales vis-a-vis de la phosphatidylcholine lorsque les liposomes contiennent de l’acide phosphatidique plutôt que de la phosphatidylsérine ou plus encore du phosphatidylinositol.
Ces résultats suggèrent d’une part, que l’activité des phosholipases lysosomiales vis-a-vis de la phosphatidylcholine est fonction de la nature du phospholipide acide inclus dans des liposomes et d’autre part qu’il n’y a pas de relation absolue et/ou directe entre la capacité de la gentamicine à se lier aux bicouches chargées négativement et l’effet inhibiteur de cet antibiotique sur l’activité des phosphatidylcholine. Ce dernier effet est d’ailleurs fonction, semble-t-il, d’autres paramètres comme l’accessibilité à l’eau de l’antibiotique inclus dans la bicouche lipidique.
Grâce à la technique de partition entre deux polymères en phase aqueuse des différents types de liposomes préparés nous avons pu réaliser ce premier objectif et montrer qu’il n’existait pas nécessairement de relation absolue et/ou directe entre la charge négative portée par la bicouche lipidique et l’activité des phospholipases lysosomiales vis-a-vis de la phosphatidylcholine. En effet, la charge portée par la couche externe des liposomes semble moins importante lorsque le phospholipide acide inclus dans la bicouche lipidique est l’acide phosphatidylinositol et ce, quelque soit le pourcentage dephospholipide acide présent. Par contre, l’activité des phospholipases lysosomiales vis-à-vis de la phosphatidylcholine est d’autant plus importante que les liposomes contiennent comme phospholipides acides de l’acide phosphatidique ou de la phosphatidylsérine ou du phosphatidylinositol. Selon ces résultats, l’activité des phospholipases lysosomiales serait donc inversement proportionnelle à la quantité de charges négatives portées par les bicouches. Néanmoins, avant de tirer une conclusion aussi hâtive, il faut noter que nos données sont en contradiction avec celles rapportées dans la littérature. En effet, il est connu que les phospholipides se répartissent de façon asymétrique entre la face interne et externe de la bicouche. L’acide phosphatidique, par exemple, serait localisé du côté externe de la membre, ce qui en accord avec le haut pouvoir fusogénique de ce phospholipide (Bondeson et. al, 1984). Par contre, la phosphatidylsérine serait localisée dans la monocouche interne des membranes cellulaires (op den kamp, 1979; Quist de Barker, 1983).
Par ailleurs, les résultats de Jocelyne Piret (1989) ont montré que les paramètres de liaison décrivant l’interaction qui s’établit entre la gentamicine et les liposomes contenant les différents phospholipides acides ne présentent pas de différences importantes selon la nature du phospholipide chargé négativement considéré. Ceci suggérant l’absence de différence de répartition des liposomes chargés négativement par les différents phospholipides acides envisagés distribués entre le feuillet interne et externe. Enfin, il faut mentionner que les résultats de partition de liposomes chargés négativement entre deux polymères en phase aqueuse, s’ils se traduisent bien, pour un phospholipide acide donné, la quantité de ce phospholipide présent semble influencer par la nature de ce dernier.
Si l’on ne comprend pas encore parfaitement l’influence de la nature d’un phospholipideacide inclus dans les liposomes sur l’activité des phospholipases lysosomiales vis-à-vis de la phosphatidylcholine et de leur inhibition par les aminoglycosides, nous avons voulu dans un second temps, tester l’influence de la présence d’un ganglioside comme lipide chargé négativement.
Les résultats obtenus montrent que la présence d’une charge négative n’est pas, en soi, un facteur suffisant pour augmenter l’activité des phospholipases lysosomiales via-à-vis de la phosphatidylcholine. De plus, nos travaux montrent, pour la première fois à notre connaissance, que les aminoglycosides peuvent se lier aux membranes qui contiennent des gangliosides. Cette liaison de la gentamicine aux liposomes contenant des gangliosides pourrait expliquer le pouvoir inhibiteur de cet antibiotique sur l’activité des phosphatidylcholine. Par ailleurs, le pouvoir inhibiteur de la gentamicine est fonction de la nature du lipide acide inclus dans les liposomes.
Les aminoglycosides inhibent l’activité des enzymes lysosomiaux impliqués dans le catabolisme des phospholipides, c’est-à-dire les phospholipases A et C (Laurent et. al, 1982 ; Carlier et. al, 1983 ; Scwertz et. al, 1984 ; Lambricht et. al, 1986) et la syngomyélinase (Laurent et. al, 1982 ; Carlier et. al, 1983) provoquant ainsi l’accumulation de lipides comme la phosphatidylcholine, le phosphatidylinositol, la sphingomyéline. Vu le rôle important joué par les gangliosides dans plusieurs fonctions biologiques comme la communication intercellulaire, les réponses immunitaires, la régulation de la croissance et de la différenciation cellulaire, l’oncogénèse et modulation de signaux transmembranaires (Hakomori, 1981, 1986 ; Nudelman et. al, 1983 ; Weegant, 1985 ; Chan, 1987 ; Tsuji et. al, 1985), nous voudrions tester l’effet des aminoglycosides sur la dégradation des gangliosides car l’inhibition éventuelle de la ganglioside II³ Neu Ac-Gg4 Cer galactosidase ou un effet des aminoglycosides sur le cofacteur protéique nécessaire à l’hydrolyse du Gm1 pourraient avoir des conséquences importantes sur le fonctionnement cellulaire. A ce sujet, des études récentes ont apporté des résultats intéressants : d’une part Aslam et. al (1988) ont montré que l’administration de gentamicine à des rats (135 mg/kg de poids sec/jour) pendant vingt et un jour augmente de façon importante la quantité de gangliosides dans certaines parties du cerveau (la jonction et le colliculus inférieur). D’autre part, Kishore et. Al (1988) rappotent que la gentamicine ou la nétilmicine (10mg/(kg.jour) pendant 4 à 10 jours) augmentent le contenu du cortex rénal des rats traités en acide sialique qui est lié aux lipides et aux protéines. Ces observations pourraient résulter d’une perturbation dans le métabolisme des glycosides (et des glycoprotéines).
Par ailleurs, vu effet important de la nature du lipide chargé négativement présent aux environs du substrat sur l’activité des phospholipases lysosomiales et leur inhibition par les aminoglycosides, nous aimerions tester, dans les mêmes conditions, l’effet des sulfatides. Au préalable, nous essayerons de caractériser la distribution des sulfatides au sein des membranes biologiques car ces lipides, tout comme les gangliosides, sont connus pour former des domaines.
De plus, nous essayerons de mieux comprendre certains des résultats obtenus dans ce travail en étudiant par exemple l’asymétrie de distribution des phospholipides acides dans les membranes par résonance magnétique nucléaire et la formation de domaines de gangliosides par calorimètrie différentielle

Medical Laboratory Science --- Aminoglycosides --- Phospholipases --- Liposomes