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L’étude de la protéine P1 chez quelques souches de référence, par agglutination dans leur sérum P1 homologue et dans des sérums P1 hétérologues, nous a permis d’établir un schéma de la diversité antigénique de la protéine P1 pour ces souches ; ce schéma est confirmé par des techniques de biologie moléculaire.
Deux particularités de la protéine P1 – sa structure en fibrilles et son caractère de protéine de membrane externe attachée à la surface de la bactérie - nous ont permis de la mettre en évidence par cette technique simple qu’est l’agglutination sur lame.
La détection de P1 réalisée en parallèle avec les tests de CA++ dépendance et d’autoagglutination définit cette protéine non seulement comme marqueur de virulence mais aussi comme témoin de la présence du plasmide pYV.
Enfin, la mise en évidence des divers facteurs de P1 sur un vaste échantillon de souches pathogènes introduit de nouvelles subdivisions ne correspondant pas à la classification en biosérogroupes. La protéine P1 constitue dès lors un marqueur de choix pour des études épidémiologiques

Yersinia enterocolitica

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Dans un premier temps, la distribution du gène ymoA au sein de différentes souches de Yersinia et quelques autres espèces bactériennes a été étudiée. Les résultats de cette étude de prévalence ont montré que toutes les souches de Yersinia possèdent la gène ymoA (175/175) mais que toutes les autres bactéries testées (0/12) en sont dépourvues. On pourrait en conclure qu’YmoA est une protéine spécifique des Yersinia, mais il faut interpréter ce résultat avec un certain degré de prudence étant donné que uniquement 12 autres espèces bactériennes ont été testées.
L’hypothèse qui prévaut jusqu’ici est qu’YmoA est une protéine de type histone. Cette hypothèse est basée sur certaines caractéristiques d’YmoA (en l’occurrence la petite taille et la séquence riche en acides aminés chargés) et sur le comportement de l’ADN chromosomique des mutants ymoA (Cornelis et al, 1991). Il n’ya cependant pas d’homologie de séquence entre YmoA et les autres protéines de type histone.
Pour éclaircir ce point, nous avions besoin de posséder des grandes quantités d’une préparation purifiée de la protéine afin d’étudier son activité in vitro et de préparer un antisérum spécifique.
Nous avons d’abord visualisé et surproduit au moyen du système de l’ARN polymérase et promoteur Φ 10 du phage T7 dans E.coli et nous avions ainsi obtenu un important stock de bactéries surproductrice d’YmoA sous une forme insoluble. Au moyen du LS 0,5 % EDTA 1 mM la protéine YmoA a été solubilisée et a alors été purifiée par des précipitations successives au sulfate d’ammonium et électro-élution, dialysée et utilisée pour faire des essais de retard de migration d’ADN en gel. Aux quantités utilisées en YmoA « pure » (1,5-6 µg) nous n’avons pas observé de retard de migration. Ce résultat négatif peut être expliqué par le fait que les quantités utilisées ne sont pas adéquates ou que le protéine n’est pas soluble à la force ionique utilisée (concentration en sel 3mM). Une autre explication de ce résultat négatif serait qu’YmoA est une protéine qui interagit avec une protéine de type histone absente dans l’extrait purifié ou qu’YmoA est une protéine de type histone dont l’effet sur l’ADN requiert la présence sur cet ADN d’autres protéines de type histone.
Après avoir surproduit et solubilisé YmoA dans E.coli, nous l’avons également électro-éluée afin d’obtenir un antisérum spécifique. Au moyen de cet antisérum nous avons mis au point les conditions pour réaliser un immunoblot afin de pouvoir détecter YmoA dans des souches de Yersinia. Pour ce faire, il fallait concentrer considérablement les échantillons et utiliser des gels à base de tricine qui permettent de concentrer les protéines de petite taille en de fines bandes et révéler les immunoblots par la réaction à la phosphatase alcaline. Toutes ces étapes qui ont été mises en œuvre pour détecter YmoA chez Toutes ces étapes qui ont été mises en œuvre pour détecter YmoA chez Yersinia montre qu’YmoA n’est pas une protéine très abondante. Ceci nous mène à la même conclusion que celle suggérée par le résultat des retards sur gel : il semble qu’YmoA soit une protéine parmi d’autres protéines de type histoire. Les histones existent à raison de 20.000 à 50.000 copies par cellules, ce qui permet de les détecter facilement par immunoblot. Par contre, si le nombre de copies diminue, il devient plus difficile de détecter la protéine mais il devient aussi difficile de s’imaginer qu’une protéine qui a un nombre de copie inférieur à 20.000 puisse être seule responsable du surenroulement de l’ADN sauf si elle interagit avec d’autres protéines.
Par la technique d’immunoblot nous avons également montré qu’YmoA possède une affinité pour l’AN ; ceci est bien en faveur de l’hypothèse qu’YmoA est une protéine de type histone.
Nous avons également mis en évidence deux formes d’YmoA/ ces deux formes d’YmoA ont été vues après la dialyse d’YmoA purifiée par des précipitations successives au sulfate d’ammonium. On peut imaginer que l’existence de ces deux formes provient d’une dégradation mais il existe une autre hypothèse qui est beaucoup plus attractive. C’est de suggérer qu’il existe deux formes de la protéine YmoA suite à une modification in vivo : phosphorylation, méthylation…
Ce phénomène de modification est connu chez les histones eucaryotiques et procaryotiques (H1). Pour pouvoir confirmer cette hypothèse, il faudrait mettre au point les gels base d’acide acétique et d’urée. C’est ce type de gel qui a été utilisé pour mettre en évidence les différentes formes des histones eucaryotiques.

Yersinia enterocolitica --- Histones --- Medical Laboratory Science --- YmoA protein, Yersinia enterocolitica

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La croissance des Yersinia in vitro est optimale à 37° en présence d’une concentration millimolaire en ions Ca[2+]. En absence de Ca [2+] et à 37°, les Yersinia cessent de croître et sécrètent une série d’au moins one protéines appelées Yops, dont la plupart sont impliquées dans la virulence des Yersinia. Ce phénomène de restriction de la croissance connu sous le nom de « dépendance vis-à-vis du Ca[2+] » pourrait être simplement une conséquence de la production massive des protéines Yop. Les gènes codant pour les protéines Yop sont dispersés sur un plasmide de 70kb, appelé pYV pour « plasmide of Yersinia virulence ». Outre les Yops, ce plasmide code également les protéines impliquées sans leur sécretion ainsi que les protéines impliquées dans la régulation de l’expression des gènes yop. VirF, une des protéines de régulation, active la transcription des gènes yop à 37°C.
Le séquençage d’un fragment d’ADN situé juste en amont de virF a dévoilé l’existence d’un gène codant pour une petite protéine basique de 14.7 kDa appelée VirG. VirG présente 29.2% d’identité avec ExsB, un régulateur nécessaire pour la synthèse de l’exoenzyme S, une protéine de virulence de P. aeruginosa.
Ce travail a été consacré à l’étude de la fonction du gène virG. Pour cela, un mutant non polaire du gène virG a été construit afin de pouvoir comparer son phénotype avec celui de la souche sauvage. Nous avons étudié la dépendance vis-à-vis des ions Ca[2+], la production des protéines Yop et la croissance en milieu liquide. L’étude de la dépendance vis-à-vis des ions Ca[2+] et de la production des Yops nous a permis de révéler un nouveau phénotype pour le mutant virG jamais observé auparavant : le mutant virG est Ca[2+] –indépendant, mais en absence de Ca[2+], il sécrète de façon massive la plupart des protéines Yop (sauf LcrV). L’hypothèse que la restriction de la croissance observée à 37°C en absence de Ca[2+] , serait une conséquence de la production massive des Yops est donc (au moins partiellement) incorrecte : VirG participe à la régulation de la croissance à 37°C en fonction de la concentration du Ca[2+]. Nous ne pouvons néanmoins pas exclure que le phénotype du mutant VirG ne soit pas influencé par l’abolition de la sécrétion de LcrV, puisque LcrV semble également être impliquée dans la régulation de l’expression des gènes yop. En milieu liquide, le taux de croissance du mutant virG n’atteint pas le niveau maximal caractéristique de la souche sauvage en présence de Ca[2+]. Ceci indique qui VirG n’est probablement pas la seule protéine impliquée dans la restriction de croissance de Y enterocolitica à 37°C en fonction de la concentration du Ca[+2]. Après transcomplémentation du mutant virG, nous avons pu rétablit le phénotype sauvage en ce qui concerne la dépendance vis-à-vis du Ca[2] et la production des protéines Yop, mais pas en ce qui concerne la croissance à 37°C en milieu liquide. Finalement, nous avons montré que virG est une lipoprotéine au moins exportée vers le périplasme.

Yersinia enterocolitica --- Growth Substances --- Medical Laboratory Science

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I.1 Les Yersinia
Les bactéries du genre Yersinia appartiennent à la famille des entétobactériacées. Ces organismes pathogènes pour l’homme et les rongeurs sont responsables de maladies telles que la peste (Yersinia pestis) ou de yersinioses dont la gravité va d’une entérite (Yersinia enterocolitica) à une septicémie pouvant être mortelle (Yersinia pseudotuberculosis) (pour revue, voir Cornelis et coll., 1987b).
Plusieurs fonctions de virulence ont été identifiées chez les Yersinia :
- Deux gènes impliqués dans l’invasion des cellules épithéliales cultivées in vitro, inv et ail, ont été clonés à partir du chromosome de Y. pseudotuberculosis et de Y. enterocolitica (Isberg R. et coll., 1987 ; Miller VL et Falkow S., 1988).
- Y. pestis, Y. pseudotuberculosis et certaines souches de Y.enterocolitica synthétisent à partir du chromosome des protéines régulées par le fer et qui sont probablement impliquées dans la captation de fer au cours de l’infection (Carniel E. et coll., 1987 ; Heesemann J. et Grüter L., 1987).
- Y.enterocolitica sécrète, basse température, une toxine apparentée à l’entérotoxine ST de E.coli (Takao T. et coll., 1985).
- les souches virulentes deY.pestis produisent une coagulase et un activateur du plasminogène, tous les deux encodés par le gène pla situé sur un plasmide de 9.5kb qu’on ne trouve que chez les Y.pestis (Sodeinde O.A. et Goguen J.D., 1988) ; il faut signaler que dans cette même espèce, on trouve un troisième plasmide de 100 kb (Protsenko et coll., 1983).
- enfin, les trois espèces virulentes sécrètent en grande quantité un assortiment de protéines appelées Yops (pour « Yersinial Outer Membrane Proteins ») codées par un plasmide de 70 kb appelé pYv (cfr. figure 1).
La perte de cette dernière propriété est toujours associée à la perte de pathogénicité

Medical Laboratory Science --- Yersinia enterocolitica --- Sequence Analysis

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Le genre Yersinia comporte trois espèces pathogènes. Il s’agit de Y.enterocolitica, Y. pseudotuberculosis et Y. pestis. la virulence de ces bactéries dépend à la fois du chromosome et d’un plasmide d’environ 70 Kb, appelés pYV pour « Plasmid involved in Yersinia virulence ». Il apparaît très conservé dans ces trois espèces.
Le plasmide pYV des Yersinia code des protéines, appelées Yop, qui sont sécrétées dans le milieu environnant. Le système de sécrétion des protéines Yop constitue l’archétype du système de sécrétion de type III. Le plasmide pYV code également une protéine de membrane externe appelée YadA et une lipoprotéine appelée YlpA.
La région comprise entre les coordonnées 1,5 et 4 du plasmide pYV de Y. enterocolitica contient un opéron codant 2 protéines de 84,5 et 30 kDa nommées YopO et YopP respectivement. Chez Y. pseudotuberculosis, une protéine d’environ 80 kDa est également sécrétée par le système de type III. La séquence du gène YpkA et la fonction de la protéine YpkA sont connus. En effet, YpkA est une sérine/thréonine présentant une similitude avec les sérines/thréonines kinases d’origine eucaryote. Son rôle serait donc de phosphoryler des protéines présentent dans le cytosol des cellules eucaryotes.
Ce travail a été consacré à l’étude de la protéine YopO de Y. enterocolitica. Dans un premier temps, la séquence du gène YopO a été déterminée. L’analyse de cette séquence a révélé la présence de 2 grilles de lecture ouverte. La première, de 155 codons, présente une similitude avec une protéine de Y. pseudotuberculosis en amont de YpkA. Le deuxième code de la protéine YopO de 81 323 Da qui présente 96,7 % d’identité avec la protéine YpkA de Y. pseudotuberculosis.
Cette similitude laisse à penser que YopO est également une sérine/thréonine kinase quoi serait internalisée dans les cellules eucaryotes. L’étude de la translocation de la protéine YopO au moyen d’une adénylate comme enzyme reporter a été réalisée à l’aide de deux protéines hybrides YopO-adénylate cyclase. Seule la protéine hybride contenant les 142 résidus amino-terminaux de YopO est internalisée dans les macrophages. Ce processus est dépendant d’autres protéines Yop : un mutant incapable de sécréter les protéines YopB et YopD n’internalise pas la protéine hybride dans les cellules eucaryotes.

Yersinia enterocolitica --- Translocation, Bacterial --- Macrophages --- Medical Laboratory Science