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Activating Transcription Factor 3 (ATF3) est un membre de la famille de facteurs de transcription ATF/CREB. Différents stimuli dont le stress du RE, les cytokines et l'hypoxie augmente son expression. Ces stimuli sont retrouvés lors de l 'exercice et pourraient potentiellement induire l'expression d'ATF3 dans le muscle squelettique. ATF3, de par sa nature, régule l'expression de gènes dans de nombreux tissus. Néanmoins, les gènes régulés par ATF3 dans le muscle squelettique n'ont pas encore été découverts.OBJECTIFS :Déterminer les changements d'expression d'ATF3 dans le muscle squelettique après l'exercice,Décrire le phénotype musculaire de souris ATF3 knock-out (KO) au repos,Déterminer les gènes régulés par ATF3 dans le muscle squelettique lors d'un exercice d'endurance.MÉTHODES : L'expression d'ATF3 a été mesurée chez des souris femelles wild-type (31 semaines) au repos (n=3) et après un exercice jusqu'à épuisement sur un tapis roulant. Les muscles Soléaire (S), Quadriceps (Q) et Gastrocnémien (G) ont été prélevés. L'expression de l'ARNm et de la protéine a été mesurée par RTqPCR ou Western blot (WB), respectivement.Pour caractériser le rôle d'ATF3 sur le phénotype musculaire, des souris mâles ATF3 KO et CON de la même portée (12-15 semaines) ont été utilisées. S, Q et G ont été analysés. L'expression d'enzymes du métabolisme (SDH, COX IV, et GAPDH) a été mesurée par WB. L'expression de marqueurs de l'inflammation (IL-6, IL-l p, Ccl2 et TNFa) a été mesurée par RTqPCR. L'activité enzymatique de la CS a été déterminée par un test enzymatique.Afin de déterminer les gènes régulés par ATF3, des souris mâles ATF3 KO et CON (15-16 semaines) ont été utilisées. Pour chaque génotype, un groupe est resté au repos et l'autre groupe a couru jusqu'à épuisement (n=6 par groupe). Les souris ayant couru ont été sacrifiées 3h après l'exercice. Le Q a été analysé par rnicroarray (MoGene 2.0 ST, Affymetrix®). Les gènes d'intérêt ont été confirmés par RTqPCR dans le Q, mais aussi testés dans le S et le G.RÉSULTATS : L'ARNm d'ATf 3 a atteint son maximum 1h après l'exercice dans S, Q et G. La protéine n'a pas été détectée au repos, mais le fut après l'exercice dans S, Q et G. Aucune différence n'a été observée dans les marqueurs de phénotypage entre les souris ATF3 KO et CON. L'analyse du rnicroarray a révélé que la délétion d'ATF3 a affecté la réponse inflammatoire à l'exercice. L'expression de certaines chémokines (Ccl6, Ccl8, Ccl l7 et Cxcl l3) a été altérée dans le Q. Il est à noter que l'effet est plus prononcé dans le S, et est associé à une infiltration de macrophages plus élevée après l'exercice chez les souris ATF3 KO.CONCLUSIONS : L'expression d'ATF3 augmente dans le muscle squelettique de souris après l'exercice. Cependant, il n'influence pas le phénotype musculaire au repos. Enfin, ATF3 semble réguler l'expression génique de certaines chémokines dans le muscle squelettique. Cette régulation pourrait être liée au contrôle de l'infiltration de macrophages. The activating Transcription Factor 3 (ATF3) is a member of the ATF/CREB family of transcription factors. Stimuli such as ER stress, cytokines and hypoxia increase ATF3 expression. These stimuli are present during exercise. The stimuli are present during exercise, potentially inducing ATF3 expression in skeletal muscle are unknown. Purpose: to determine the changes in AFT3 expression in skeletal muscle after exercise. To characterize the phenotype of ATF3 knock-out mice at rest, focusing on skeletal muscle. To determine the genes regulated by ATF3 during endurance exercise in skeletal muscle. Methods: The ATF3 expression was measured in female wild-type mice (31-week-old) at rest (n=3) and after an exercise on a treadmill pursued until exhaustion. Soleus, (S), quadriceps (Q) and gastrocnemius (G) were dissected. ATF3 mRNA and protein were determined by RTqPCR and Western blot (WB), respectively. Male ATF3 KO mice and their control (CON) littermates (12-15-week-old) were used to study the influence ATF3 on muscle phenotype. S, Q and G were analyzed. The expression of metabolic enzymes (SDH, COX IV and GAPDH) was assayed by WB. The mRNA of inflammatory markers (IL-6, Il-1β, Ccl2 and TNFα) was measured by RTqPCR. Finally, the enzymatic activity of CS was determined by an enzymatic assay. To determine the ATF3-regulated genes, male ATF3 KO and CON mice (15-16-week-old) were used. For each genotype, a group was kept at rest and another group was exercised until exhaustion (n=6 per group). Exercising mice were sacrificed 3 h after exercise. Q muscles were analyzed by microarray (MoGene 2.0 ST, Afffymetrix®). Genes of interest were confirmed by RTqPCR in Q, and also assayed in S and G. Results: ATF3 mRNA peaked 1 h after exercise in all muscles. At the protein level, ATF3 was undetectable at rest, but became detectable after exercise in all muscles. There were no differences between ATF3 KO and CON mice in any of the phenotyping markers. The analysis of the microarray revealed that ATF3 deletion affected the inflammatory response to exercise. ATF3 altered the expression of some chemokines (Ccl6, Ccl8, Ccl17 and Cxcl13) in Q. Interestingly, the effect was more pronounced in S, and was associated with higher macrophage infiltration after exercise in the ATF3 KO mice. Conclusions: ATF3 expression increases in mouse skeletal muscle after exercise. However, ATF3 does not influence the phenotype of skeletal muscleat rest.Finally, ATF3 seems to regulate the genetic expression of some chemokines in skeletal muscle. This regulation might be related to the control of macrophage infiltration.

Activating Transcription Factor 3

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Glucose is the main physiological stimulus of insulin secretion by pancreatic islet β-cells. In the long term, glucose also exerts complex effects on the functional β-cells mass. In vitro, rat β-cell survival and function are optimally preserved during culture in the presence of 10 mmol/l glucose (G10) and are markedly altered at either higher (30 mmol/l or G30) or lower (2 mmol/l or G2) glucose concentrations. Among genes that are affected by glucose in cultured rat islets, the mRNA levels of integrated stress response (ISR) genes follow a V-shaped profile similar to that of apoptosis, with a minimum in G10, a large increase in G2 and a moderate increase in G30. The ISR is initiated by the phosphorylation of the α subunit of eukaryotic initiation factor 2 by various types of stress, including endoplasmic reticulum stress. It is characterized by increased expression of Activating Transcription Factor 4 (ATF4)-target genes, such as the proapoptotic transcription factor Atf3 and its potential target Growth arrest- and DNA damage-inducible gene 153 (Gadd153). The aim of this work was to test the role of Atf3 in the induction of mouse islet cell apoptosis during prolonged culture in low and high vs intermediate glucose concentrations.
As in rat islets, culture of wild-type (WT) mouse islets in G2 vs G10 rapidly (18h) increased Atf3 and Gadd153 to Tbp mRNA ratios (real time PCR) and later (3-7 days) induced islet cell apoptosis (caspase activation and DNA fragmentation). In contrast, culture in G30 only slightly increased the mRNA levels of ISR genes as well as islet cell apoptosis. In islets from Atf3 knockout mice (Atf3-/-), the effects of G30 vs G10 on apoptosis and ISR gene mRNA levels were not different from those in WT islets. In contrast, the level of apoptosis induced by one week culture in G2 was ~50% lower in Atf3-/- vs WT islets in 3 out of 7 experiments (mean reduction of ~25%). In parallel, the mRNA level of Gadd153 was significantly lower in Atf3-/- islets after 3 or 7 days but not 18h culture in G2. On the other hand, the increase in the mRNA levels of the antiapoptotic oxidative stress-response gene Metallothionein 1a (Mt1a) induced by culture in G2 was significantly larger in Atf3-/- vs WT islets after 18h but not after 3 or 7 days of culture.
In conclusion, the increase in Atf3 gene expression induced by culture in a low glucose concentration only slightly contributes to the stimulation of islet cell apoptosis by a mechanism that may involve a late increase in the expression of the proapoptotic gene Gadd153 or an early reduction of the expression of the antiapoptotic gene Mt1a. Le glucose est le stimulus physiologique majeur de la sécrétion d’insuline par les cellules β situées au sein des îlots pancréatiques de Langerhans. A plus long terme, il exerce également des effets complexes sur la masse fonctionnelle de ces cellules. En effet, la fonction et la survie des cellules β d’îlots de rat sont préservées de manière optimale par la culture en présence de 10 mmol/l glucose (G10) alors qu’elles sont altérées par les concentrations de glucose plus faibles et plus élevées (2 et 30 mmol/l, G2 ou G30). Parmi les gènes dont l’expression est modifiée par le glucose dans les îlots de rat, les ARNm des gènes de la réponse intégrée au stress (ISR) suivent un profil en V asymétrique semblable à celui de l’apoptose, avec un minimum en G10 et une augmentation importante en G2 et plus faible en G30. L’ISR résulte de la phosphorylation du facteur eucaryote d’initiation de la traduction eIF2α par différents types de stress, y compris un stress du réticulum endoplasmique. Elle se caractérise par une augmentation de l’expression de gènes cibles d’ATF4, dont les facteurs de transcription proapoptotiques Atf3 et sa cible potentielle Gadd153. Au cours de mon mémoire, j’ai étudié le rôle d’Atf3 dans l’apoptose des cellules d’îlots de souris cultivées en présence de concentrations extrêmes (faible et élevée) de glucose.
Comme dans les îlots de rat, la culture d’îlots de souris C57BL/6J (Ctrl) en présence de G2 au lieu de G10 augmente rapidement (18h) l’expression des ARNm d’Atf3 et de Gadd153 (PCR en temps réel) et plus tardivement (3-7 jours) l’apoptose des cellules de l’îlot (mesures de l’activation des caspases et de la fragmentation de l’ADN). Par contre, la culture de ces îlots en présence de G30 vs G10 n’augmente que très légèrement l’expression des gènes de l’ISR ainsi que l’apoptose. Dans des îlots de souris dont le gène Atf3 a été inactivé (souris Atf3-/-), l’effet du G30 vs G10 sur l’expression des gènes de l’ISR et sur l’apoptose n’est pas différent de celui observé dans les îlots de souris Ctrl. Par contre, le taux d’apoptose induit par une semaine de culture en G2 est ~50% plus faible dans les îlots de souris Atf3-/- pour la moitié des expériences (3/7) et comparable pour les autres expériences (réduction moyenne de ~25% pour toutes les expériences). Parallèlement, le taux d’expression de l’ARNm de Gadd153 est significativement plus faible dans les îlots de souris Atf3-/- après 3 et 7 jours de culture en présence de G2 malgré un taux semblable observé après 18h de culture. D’autre part, l’expression de l’ARNm du gène de réponse au stress oxydant métallothionéine 1a (Mt1a), dont la surexpression a des effets antiapoptotiques dans les cellules β, est significativement augmentée dans les îlots de souris Atf3-/- comparés aux îlots de souris Ctrl après 18h de culture en présence de G2, mais aucune différence n’est observée après 3 et 7 jours de culture.
En conclusion, l’augmentation d’expression d'Atf3 contribue de façon peu reproductible à l’apoptose des cellules des îlots de souris cultivés en présence d’une concentration faible de glucose par un mécanisme qui pourrait impliquer une augmentation tardive de l’expression du gène proapoptotique Gadd153 ou une diminution précoce de l’expression du gène antiapoptotique Mt1a

Activating Transcription Factor 3 --- Insulin-Secreting Cells --- Apoptosis

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T cells directed against tumor-associated antigens can be detected in several types of cancers, including melanoma. Cytotoxic T lymphocytes recognize antigens at the surface of tumor cells and therefore can induce the lysis of those cells. The genes coding for some of these antigens have been identified : they are differentiation genes and are expressed also in normal melanocytes. They encode the tyrosinase, the tyrosinase related proteins 1 and 2, Melan-A/MART1 or gp100/PMEL17.
However, some tumor cells reduce the expression of these antigens and then evade the anti-tumoral immunity. In melanoma cells cultivated in the presence of IL-1, several experiments have shown a decrease in the expression of these differentiation genes and of the transcription factor MITF-M (Microphtalmia-associated transcription factor), which regulates them. It can be suggested that this cytokine, present in the tumoral environment, may be responsible for the decrease in the expression of differentiation antigens and, therefore, favour the escape of tumor cells from the immune system. But, the mechanism used by IL-1 to induce this repression is still unknown. The aim of this work was to study this mechanism.
The first step was to test whether IL-1 acts on the MITF-M promoter or on the mRNA stability. We performed plasmid constructions with the MITF-M promoter (15 kb or 4,5 kb) upstream the luciferase gene and we measured the luciferase activity in the presence or not of IL-1. These experiments do seem not to implicate the promoter in the repression induced by this cytokine.
Then we have tried to evaluate whether there was an instability of the MITF-M mRNA and we expressed plasmid constructs in different tumor cell types (melanomas LB 2259 and LAGI and neuroblastoma SKNBE2) to determine the exact region of the mRNA that can be a target for the signal induced by IL-1. We perfomed constructs with the complete cDNA of MITF or only with the 3’UTR because this region is particulary long (3 kb) and can be responsible for transcript instability. However, although we could not identify the exact region implicated in this regulation, we concluded from our data that the 3’UTR alone was not capable to destabilize the transcript in the presence of IL-1ß.
LB 2259 melanoma cells were also incubated with transcription inhibitors and IL-1 to study MITF-M mRNA decay. These experiments allowed us to conclude that IL-1 does not directly influence MITF-M mRNA stability but promotes the transcription of factors responsible for the decrease in MITF mRNA levels Il a été mis en évidence dans certains types de cancer, dont les mélanomes, qu’il pouvait exister une réponse immunitaire anti-tumorale. Cette réponse est principalement médiée par des lymphocytes T cytolytiques (CTL) capables de reconnaître des antigènes à la surface des cellules de mélanome et d’induire la lyse de ces cellules. Les gènes codant certains de ces antigènes ont été identifiés : il s’agit de gènes exprimés également dans les mélanocytes normaux et qui sont impliqués dans la différenciation des mélanocytes. Ils codent la tyrosinase, les « tyrosinase related proteins », Melan-A/MART1 ou gp100/PMEL17.
Cependant, certaines cellules tumorales vont pouvoir échapper à la réponse immunitaire en réprimant l’expression de ces antigènes de différenciation. Des expériences préalables ont permis d’observer une diminution de l’expression de ces antigènes de différenciation ainsi que d’un facteur de transcription qui les régule, MITF-M (Microphtalmia-associated transcription factor), dans des mélanomes cultivés en présence d’IL-1. Ceci pourrait suggérer que cette cytokine, présente dans l’environnement de la tumeur, serait responsable de la diminution d’expression des antigènes de différenciation et donc de l’échappement à la réponse immunitaire. Cependant, le mécanisme par lequel l’IL-1ß induit cette répression est encore mal connu. Le projet de ce mémoire est d’étudier ce mécanisme.
Une première étape était de savoir si l’IL-1 agit au niveau du promoteur du gène ou au niveau de la stabilité de l’ARNm. Nous avons donc réalisé des constructions contenant le promoteur du gène MITF-M (15 kb ou 4,5 kb) en amont du gène de la luciférase et mesuré l’activité luciférase en présence ou non d’IL-1. Ces expériences ne semblent pas indiquer que le promoteur soit impliqué dans la répression induite par cette cytokine.
Ensuite, pour mettre en évidence une instabilité du transcrit MITF, nous avons réalisé différentes constructions dans plusieurs lignées cellulaires (mélanomes LB 2259 et LAGI et neuroblastome SKNBE2) afin de déterminer la région exacte du transcrit ciblée par l’IL-1ß. Nous avons réalisé des constructions contenant l’ADNc complet de MITF ou uniquement la région 3’UTR étant donné que celle-ci est particulièrement longue (3 kb) et pourrait donc réguler la stabilité du transcrit. Cependant, nous n’avons pas encore pu identifier la région précise impliquée dans cette régulation, la région 3’UTR seule n’étant pas capable d’induire une déstabilisation en présence d’IL-1.
De plus, la lignée de mélanome LB2259 a été cultivée en présence d’inhibiteurs de transcription et d’IL-1, afin d’étudier la vitesse de dégradation de l’ARNm de MITF-M dans différentes conditions. Ceci a permis de conclure que l’IL-1 n’influence pas directement la stabilité de l’ARNm de MITF-M mais favoriserait la transcription d’intermédiaires responsables de la diminution des taux d’ARNm

Microphthalmia-Associated Transcription Factor --- T-Lymphocytes, Cytotoxic --- Interleukin-1beta --- RNA, Messenger --- Melanoma

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Nous avons étudié le rôle de la séquence comprise entre les nucléotides -190 et +1 du promoteur du gène humain de l’hormone de croissance qui contient les sites de liaison des facteurs GHF-1/Pit-1 et Sp1 sur l’activité de ce promoteur. Pour définir le rôle de ces séquences, nous avons construit les plasmides phGH128, 149, 160 et 190Luc et correspondant à la longueur en pb du promoteur à partir du site cap 1 présent dans la construction devant un gène rapporteur luciférase. Ces plasmides ont ensuite été transfectés dans des cellules GC et des cellules HeLa. Nous avons mis en évidence que l’addition de la séquence -149 à -128 stimule fortement la transcription dans les cellules GC. Nous attribuons cet effet à la fixation du facteur Sp1, un puissant activateur de la transcription comme l’ont démontré des expériences de transfection dans les cellules HeLa. Or des expériences de « footprinting » à la DNAse I avec des cellules GC ont montré que la fixation de GHF-1/Pit-1 et Sp1 est mutuellement exclusive et en faveur de GHF-1/Pit-1. Pour expliquer la stimulation observée dans les cellules GC, nous avons émis l’hypothèse d’une titration du facteur GHF-1/Pit-1 par une partie des phGH dans les cellules transfectées et de la stimulation indépendante de la fraction des phGH encore disponibles par le facteur SP1 responsable de l’effet observé. Nous avons également mis en évidence une diminution du taux de transcription par la fixation d’un facteur inconnu sur la séquence -160 à -190 pour laquelle aucun site de liaison n’a encore pu être démontré.
Nous avons également recherché un GRE (Glucocorticoid responsive Element) potentiel entre les deux sites de liaison du facteur GHF-1/Pit-1 sur phGH en réalisant des expériences de transfection de constructions contenant cette région dans des cellules GC traitées ensuite à la dexaméthasone, un analogue des glucocorticoïdes. Nous n’avons observé aucun effet de celle-ci probablement parce que le site GRE contient une base supplémentaire dans la séquence de 3 pb située entre les deux demi-palindromes de liaison. L’augmentation de cet espacement empêcherait la liaison du récepteur des glucocorticoïdes et serait responsable de l’absence d’effet transcriptionnel de la déxaméthasone

Glucocorticoids --- Transcription, Genetic --- Growth Substances --- Medical Laboratory Science --- Sp1 Transcription Factor

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Plants are made up of a large number of distinct cell types that originate from a single fertilized egg cell. How the diversity of cell types arise in appropriate places is one of the most fascinating and attractive research areas of plant biology. During the past several decades, due to the development of new molecular techniques and tools, advances in optical microscopy, and availability of whole genome information and mutants in the model plant Arabidopsis and other plants, great advances have been made in understanding the mechanisms involved in cell fate determination in plants. Multiple mechanisms are used to generate cellular diversity. Asymmetric cell division is one of the primary mechanisms. As an example, asymmetric cell division enables one stem cell to generate a stem cell daughter and a daughter with a distinct identity. Initially equivalent cells can also differentiate to generate different cell types. This mechanism has been clearly demonstrated in the formation of multiple cell types during epidermis development in the shoot and root. Cell fate determination is influenced by both intrinsic factors, i.e, developmental regulators, as well as extrinsic signals, i.e., environmental stimuli. By using model systems like stomata, trichome, root hair and shoot and root apical meristem cells, ligands, receptors and transcription factors have been found to regulate cell fate determination. However, the details of signaling cassettes responsible for cell fate determination remain largely unknown. Plants are made up of a large number of distinct cell types that originate from a single fertilized egg cell. How the diversity of cell types arise in appropriate places is one of the most fascinating and attractive research areas of plant biology. During the past several decades, due to the development of new molecular techniques and tools, advances in optical microscopy, and availability of whole genome information and mutants in the model plant Arabidopsis and other plants, great advances have been made in understanding the mechanisms involved in cell fate determination in plants. This research topic contains 12 collected articles, including 2 Opinion Articles, 5 Reviews, 4 Mini Reviews, and 1 Original Research Article. Hopefully, these articles will expand our understanding of the regulation of cell fate determination in plants.

Cotton Fiber --- transcription factor --- stomata --- Xylem --- protein lipid modification --- root hair --- Arabidopsis --- cell fate determination --- Populus --- Trichome --- Cotton Fiber --- transcription factor --- stomata --- Xylem --- protein lipid modification --- root hair --- Arabidopsis --- cell fate determination --- Populus --- Trichome