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Transcription, Genetic --- Transcription, Genetic --- genetics --- physiology

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Le facteur de transcription hépato-spécifique HFN-6, découvert au laboratoire d’accueil, est le membre fondateur de la nouvelle classe ONECUT de protéines à domaines cut et homéo. Ces protéines sont caractérisées par la présence d’un seul domaine cut et par la nature des acides aminés en position 48 et 50 du domaine homéo. Chez la souris, le gène hfn-6 est transcrit dans le foie dès la formation du bourgeon hépatique. Il est également exprimé dans le cerveau, la rate, le pancréas, les testicules ainsi que dans la peau. Dans le foie, le facteur HNF-6 stimule la transcription de gènes contrôlant le métabolisme glucidique, codant des facteurs de transcription et contrôlant la détoxification des xénobiotiques, la coagulation ou la synthèse de protéines porteuses.
Un des thèmes de recherche au laboratoire d’accueil est l’étude des mécanismes du contrôle de la transcription du gène hfn-6. La connaissance de ces mécanismes de contrôle du promoteur hfn-6 est importante pour comprendre les mécanismes d’activation de gènes aux stades précoces du développement hépatique. L’analyse nucléotidique du promoteur du gène hfn-6 de rat révèle la présence d’un site pour le facteur HNF-4. En transfection, ce facteur hépato-spécifique est responsable de plus de 50% de l’activité du promoteur de rat. Par ailleurs, le facteur HNF-6 contrôle l’expression de HNF-4. La liaison de HNF-6 sur le gène hnf-4 induit la stimulation de la transcription. Cela crée donc une boucle de contrôle réciproque où HNF-4 stimule HNF-6n et vice versa.
Ce mémoire avait pour premier objectif de comparer les séquences promotrices du gène hfn-6 de rat et de souris. L’alignement des deux séquences promotrices révèle un degré élevé d’homologie. Toutefois, le région liant HNF-4 chez le rat n’est qu’imparfaitement conservée chez la souris. Nous avons donc vérifié si le mécanisme de contrôle du gène hfn-6 par HNF-4 était conservé entre le rat et la souris. De nos expériences d’empreinte ) la DNase I, de retardement sur gel et de transfection transitoire, il ressort que le facteur HNF-4 ne contrôlerait pas le promoteur hfn-6 de souris. Nous pouvons donc affirmer que les mécanismes de contrôle de la transcription du gène hfn-6 sont différentes entre les deux espèces animales. Par ailleurs, dans des cellules transfectées, l’activité transcriptionnelle du gène hfn-6 de rat est strictement hépato-spécifique. Chez la souris, nos expériences de transfection transitoire ont démontré que l’activité du promoteur hfn-6 n’est pas hépato-spécifique. Deux régions du promoteur hfn-6 de souris, l’une inhibitrice et l’autre stimulatrice, ont été identifiées. L’analyse nucléotidique de ces deux régions nous révèle l’existence de séquences-cis pour des facteurs de transcription ubiquistes.
Les résultats de ce mémoire indiquent que des précautions sont à prendre quant à la transposition de conclusions établies sur une espèce de rongeur à une autre espèces. L’absence de conservation de la régulation de HNF-6 par HNF-4 chez la souris pose également la question fondamentale de la validité des cascades d’activation de gènes établies par la mise en commun des données obtenues chez le rat et la souris

Liver --- Mice --- Transcription, Genetic

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TRANSCRIPTION, GENETIC --- THYMIDINE KINASE --- TRANSCRIPTION, GENETIC --- THYMIDINE KINASE

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TRANSCRIPTION, GENETIC --- CYTOCHROME-C OXIDASE --- TRANSCRIPTION, GENETIC --- CYTOCHROME-C OXIDASE

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ln this work , we aimed to develop novel tools for the analysis of function and biogenesis of micrq-RNAs . Since we worked on two different methods, this work is divided in two parts.The aim of the first part was to develop a quick, reliable and cheap method to synthesize and purify precursor-microRNAs (premiR). Our method is based on in vitro transcription by T7 RNA polymerase. To overcome limitations of this technique, we added special RNA structures (ribozymes) capable of cleaving the transcript in an autocatalytic manner and leaving only the desired premiR sequence. To be able to extract the ribozymes, which could interfere with further processing of the premiR, we added a second RNA structure (aptamer) capable of binding to an affinity matrix. Eventually, we were able to synthesize and purify different premiRs that could be cleaved by the enzyme Dicer.The second part of this thesis focused on the inhibition of micro-RNA. There already are different methods to inhibit them but they all suffer serious limitations. That's why we attempted to improve the method of the so-called micro-RNA sponges. These are transcr ipt containing many binding sites for a miR. These transcripts act as compet itive inhibitors by trapping the micro-RNA. However, these sponges are far from efficient due to the destabilization caused by the binding of the micro-RNA. This destabilization is caused by the decapping and deadenylation of the transcript. We therefore proposed that, if we were able to produce circular sponges these would probably be more stable and hopefully more efficient. To explore this hypothesis, we first tried to find a model allowing us to generate circular miRNA sponges. Three different experimental were generated and assessed for their capacity to generate circular sponge transcripts. Furthermore, we tested whether the best of the experimental systems could be integrated into a lentiviral vector that would allow us to infect a variety of cells.Future work will have to demonstrate whether the generated circular sponges are more efficient inhibitors of miRNA function when compared to their linear counterparts . Au cours de ce mémoire, nous nous sommes intéressés au développement de nouveaux outils permettant l'analyse de la fonction et de la biogenèse des micro-ARNs . Dans cette optique, nous avons exploré deux méthodes différentes. Par conséquent , ce travail est scindé en deux parties.Le but de la première partie de ce mémoire était le développement d'une méthode de synthèse de micro-RNA précurseur (premiR). A insi, nous avons mis au point une méthode sur base de la transcription in vitro. Afin d'éviter certaines contraintes du point de vue de la séquence , nous avons flanqué le premiR d'une séquence ARN particulière (ribozyme) capable de cliver tout nucléotides supplémenta ire éventuels. Ensuite, afin d'être capable d'extraire ces séquences contaminantes, nous avons complémenté les ribozymes d'une seconde structure ARN (aptamères) capable de se lier avec une matrice d'affinité. Suite à la transcription in vitro et la purification du premiR, nous avons analysé le résultat par électrophorèse en gel de polyacrylamide dénaturant et « Northern Blot ». Nous avons pu démontrer l'efficacité de notre méthode à produire des premiR, les purifier ainsi que montrer l'utilité de ceux-ci comme outils pour étudier le clivage catalysé par Dicer.La seconde partie de ce mémoire se penche sur le développement d'une nouvelle méthode d'inhibition des miRs. En effet, malgré l'existence d'outils permettant leur inhibition, ceux-ci souffrent encore de nombreux désavantages . Nous avons donc tenté d'améliorer la méthode d'éponges à miR décr ite précédemment dans la littérature. Cependant, afin d'améliorer leur stabilité, nous avec tenté de produire des éponges circulaires. Pour cela nous avons complémenté notre construction de signaux d'épissage et de séquences répétitives nécessaires à la circularisation comme décrit dans la littérature. Après transfection de nos constructions plasmidiques, nous avons mesuré les niveaux d'ARN circulaires et linéaires à l'aide de PCR quantitative . Ensuite nous avons développé des vecteurs lentiviraux permettant l'intégration stable de ces constructions. De futures études devront démonter si le système ainsi développé présente des améliorations par rapport aux autres techniques.

MicroRNAs --- RNA Splicing --- RNA --- Transcription, Genetic