Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

Theiler’s virus is a murine neurotropic virus which belongs to the Picornaviridae family. Persistent strains of this virus can produce a lifelong infection of the spinal cord, in spite of a strong immune response directed against the virus. Persistence of the virus in the spinal cord white matter induces a demyelinating disease reminiscent of human multiple sclerosis.
The L* protein expressed by Theiler’s virus is an important persistence determinant. This protein is encoded by an alternative open reading frame overlapping the main reading frame of the viral genome.
The aim of the present work was to precise the subcellular localization of protein L* , and to identify the corresponding targeting signals on the protein.
Therefore, we used confocal microscopy to analyse the subcellular distribution of the L* protein expressed by DA1 virus, or of a plasmid-encoded EGFP- L* fusion protein.
Our results show that L* colocalizes with mitochondria. This localization contrasts with the formerly reported association of L* with microtubules.
These results also suggest a link between L* protein expression and cellular apoptosis.
We then constructed a series of EGFP- L* deletion mutants to identify the mitochondria targeting signal(s) within L*. We observed that, except for a small C-terminal portion of the protein, any deletion introduced in L* prevented association of the fusion protein with mitochondria, suggesting that the targeting signal is conformational Le virus de Theiler est un virus neurotrope appartenant à la famille Picornaviridae. Les souches persistantes du virus ont la capacité de persister au niveau de la substance blanche de la moelle épinière. Cette persistance virale est accompagnée de lésions de démyélinisation semblables à celles retrouvées chez les malades souffrant de la sclérose en plaques. Parmi les éléments déterminant cette persistance virale, la protéine L* joue un rôle crucial dans l’établissement de cette persistance. Cette protéine est exprimée par un cadre de lecture alternatif chevauchant le cadre de lecture principal du génome viral.
L’objectif de ce travail de mémoire était, d’une part, de préciser la localisation subcellulaire de la protéine L* et, d’autre part, d’identifier les signaux de cette protéine déterminant sa localisation.
Nous avons analysé, par microscopie confoncale, la localisation de la protéine L* exprimée par le virus DA1 ainsi que celle d’une protéine de fusion EGFP-L*. Les images obtenues montrent la colocalisation de la protéine L* et des mitochondries. Cette localisation subcellulaire de la protéine L* contraste avec celle décrite précédemment, qui indiquait une association de cette protéine aux microtubules.
L’association de la protéine L* et des mitochondries indique que cette protéine pourrait avoir une fonction liée à l’apoptose cellulaire.
A partir d’une construction exprimant une fusion EGFP- L*, nous avons construit une série de mutants comportant des délétions de tailles variables des parties N et C-terminales de la protéine L*. A l’exception d’un petit domaine C-terminal, nous n’avons pas pu supprimer de segment de la protéine L* sans perdre la localisation mitochondriale de la protéine de fusion. Ces résultats suggèrent un adressage conformationnel de la protéine L* aux mitochondries

Theilovirus

Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

Le virus de l'encéphalomyélite murine de Theiler (TMEV) est un Cardiovirus, de la famille Picornaviridae. Les différentes souches du virus sont classées, selon le type de pathologie induite, en souches neuro virulentes et persistantes. Malgré une réponse immunitaire spécifique, les souches persistantes sont capables de persister au niveau de la substance blanche de la moelle épinière. Le virus code deux protéines accessoires : la protéine Leader (L) et la protéine L*. Ces protéines, non requise pour la réplication du virus, confèrent une protection contre la réponse immunitaire innée. La protéine L* (unique parmi la famille Picornaviridae ) est une protéine localisée partiellement dans le cytosol et partiellement dans la membrane externe des mitochondries, avec orientation cytosolique. Il a été montré que la protéine L* facilite l'infection des macrophages et est nécessaire à la persistance du virus in vivo. La fraction cytosolique de L* inhibe l'activité de la RNase L, une enzyme effectrice de la voie IFN, par une interaction directe spécifique à l'espèce. Actuellement, la raison de la localisation mitochondriale de L * est inconnue. L'analyse de virus mutants (et la capacité de L* d'inhiber la RNase L in vitro) suggèrent que la localisation mitochondriale de L* n'est pas nécessaire à l'activité anti-RNase L. Dans ce travail, nous avons étudié si L* pourrait avoir une autre fonction, indépendante de son activité anti-RNase L, liée à sa localisation mitochondriale. Pour ce faire, nous avons d'abord généré des macrophages de la lignée J774.1, déficients pour la RNase L à l'aide du système CRISPR-Cas9 nickase. Ensuite, nous avons produit des virus comportant des mutations dans les régions L et L* : W18 (WT), MD08 (LM60V), TM770 (L*STOP) and TAS, lLM60V+ L*STOP). Deuxièmement, nous avons infecté les macrophages RNase L-/- pour étudier si les virus WT pour L* (VV18 et MD08) ont un avantage réplicatif par rapport aux virus qui codent une L* tronquée (TM770 et TAS). Finalement, nous avons étudié dans les macrophages RNase L-/- différentes fonctions en lien à la mitochondrie, comme le potentiel de membrane mitochondrial et la dynamique mitochondriale (fusion et fission). Ce travail nous a permis de conclure que L* apporte un léger avantage réplicatif en absence de RNase L, augmente la production de pro-IL-lP et, induit une perte de potentiel de membrane suggérant un rôle pro-apoptotique de L*. Theiler's Murine Encephalomyelitis Virus (TMEV) is a Cardiovirus member of the Picornaviridae family. TM EV can be divided into neuro virulent and persistent strains. Persistent strains persist in the white matter of the spinal cord of mice despite a specific immune response. TMEV codes for two accessories proteins: the Leader (L) and the L* protein. These proteins are not required for the viral replication, but they confer the capacity to evade the innate immune response. The L* protein, which is only present in TMEV, is partially localized in the cytosol and partially attached into the outer mitochondrial membrane. lt has been shown that L* is essential for viral persistence in macrophages. The cytosolic fraction of L* has the capacity to inhibit the RNase L enzyme by a direct protein-protein interaction characterized by species-specific recognition. RNase L is a well-known enzyme implicated in the cellular antiviral response (and in the IFN induction pathway). Nowadays, the reason of the mitochondrial localization of L* and the function that it might play there are unknown. The capacity of L* to inhibit RNase L in vitro suggest that the mitochondrial fraction of L* is not necessary for the anti-RNase L activity. ln this project, we study if L* could have a function other than RNase L inhibition, in relation ta its mitochondrial localization. Therefore, we firstly produced RNase L-deficient J774.1 macrophages using the CRISPR-Cas9 system (nickase activity). ln parallel, we produced three different mutant viruses with mutations within the L and L* regions and a WT virus: VVlS (WT), MOOS (LM60V), TM770 (L,SToP) and TAS (LM5ov+ L*STOP). Secondly, we infected the RNase L-/- macrophages ta check if viruses with L* WT (VV18 and MOOS) have a replicative advantage in comparison to L* mutant viruses (TM770 and TAS). Finally, we studied in RNase L-/- macrophages different functions related to mitochondria as membrane potential and mitochondrial dynamics (fusion and fission).This work allowed us to conclude that L* provides a slight replicative advantage without RNase L, increases pro-IL-1 production and induces a loss of membrane potential suggesting a pro-apoptotic role of L*.

Mitochondria --- Theilovirus

Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

Theiler’s virus produces, according to the strain, an acute or chronic disease of the central nervous system of the mouse. The neurovirulent strains such as GD7 produce a fatal encephalitis while persistent strains such as DA induce a persistent disease and demyelisation in susceptible mice, despite the immune response. The persistent strain DA unlike the neurovirulent strain GD7 synthesis a protein called 1*. The latter protein increases the infection rate of macrophages by the virus. Macrophages are thought to play an important role in viral persistence and probably in the pathology induced by the virus. Enhancement of macrophage infection by protein 1* was reported to correlate with an antiapoptotic activity of this protein.
Cellular mutants resistant to the GD7 virus have been derived L929 cells in our laboratory. Those mutants have benne classified into 3 groups according to their resistance of susceptibility to different viruses. Some of these cellular mutants (including L929#25 and L929#34) exhibit a particular profile when infected by those viruses. It has turned out that the 1* protein and the replication regions (2A to 3B proteins), beside the viral capsid, influence the infection of these cellular mutants.
We have shown that the presence of the 1* protein and of the 2A-3B region of the DA virus enhance the infection of macrophages. Thos results prompted us to further characterise the L929#25 and L929#34 cellular mutants. We observed that the resistance of those mutants involve a very early stage of the viral cycle (probably just after or the entry of the virus into the cell) and not an increase of their susceptibility to apoptosis as we previously thought. We also constructed and tested new recombinant viruses in attempt to identify the factor of the 2A-3B region that promotes the infection of macrophages and of the cellular mutants. Le virus de Theiler provoque, selon les souches, une maladie aiguë ou chronique du système nerveux central de la souris. Les souches neurovirulentes, comme la souche GD7, provoquent une encéphalite mortelle tandis que les souches persistantes comme la souche DA causent, chez les souris susceptibles, une maladie persistante et démyélinisante en dépit de la réponse immunitaire. LA couche persistante DA exprime, contrairement à la souche neurovirulente GD7, la protéine 1*. Cette dernière facilite l’infection des macrophages, réservoir potentiel du virus lors de la persistance. L’action de cette protéine pourrait s’exercer par un effet antiapoptotique.
Des mutants cellulaires L929 devenus résistants à l’infection par le virus GD7 ont été obtenu dans notre laboratoire. Certains de ces mutants cellulaires (dont les lignées L929#25 et L929#34) présentent un profil d’interaction particulier par les différents virus. Il s’avère que la protéine 1* et la région de réplication (protéines 2A à 3B), outre la capside virale, influencent l’infection de ces mutants.
Nos avons montré que l’infection des macrophages est également facilitée par la présence de la protéine 1* et de la région 2A-3B du virus DA. Cela nous a poussé à caractériser d’avantage les mutants L929#25 et L929#34. Nous avons observé que la résistance de ces mutants intervient dans une étape très précoce du cycle viral (sans doute juste au moment ou après l’entrée du virus dans la cellule) et ne provient pas d’une augmentation de leur sensibilité à l’apoptose comme nous le pensions ? Nous avons construit et testé des virus recombinants pour tenter de mettre en évidence le facteur présent dans cette région 2A-3B qui favorise l’infection des macrophages et des mutants cellulaires.

Theilovirus --- Macrophages --- Infection

Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

Theiler’s virus is a murine picornavirus causing chronic infections of the central nervous system. The 2A protein of this virus is 134 amino acid-long. The C-terminal 18 amino acids of this protein are involved in co-translational processing of the polyprotein encoded by the virus. The N-terminal part of the protein diverges from the 2A proteins of other picornaviruses and shares no clear similarity with any known protein. Theiler’s virus mutants carrying deletions in the 2A region showed abnormal processing of the L-capsid-2A protein precursor.
The aim of this work was to analyze revertant viruses selected previously from such 2A deletion mutants. We obtained infectious viral cDNA clones carrying the capsid-2A and/or the VP1-2A region of two 2A revertants. The sequence of these viruses and the analysis of recombinant viruses constructed from these clones indicated that mutations within the 2A sequence were primarily responsible for the “revertant” phenotype. These reversion mutations likely restore the processing defect of the L-capsid-2A protein precursor, which was detected in the 2A deletion mutants Le virus de Theiler est un picornavirus responsable d’infections persistantes du système nerveux central de la souris. La protéine 2A de ce virus est l’une des protéines les moins bien connues du point de vue de sa fonction dans le cycle viral. Nous savons que l’extrémité C-terminale de cette protéine est impliquée dans le clivage co-traductionnel de la polyprotéine codée par le virus, au niveau de la jonction 2A/2B. Le rôle du reste de la protéine 2A reste inconnu. Des mutants du virus de Theiler contenant des délétions introduites dans la région 2A subissent un clivage anormal de la protéine précurseur L-capside-2A. Une série de révertants ont été isolés précédemment au laboratoire à partir de tels mutants.
L’objectif de ce travail était de cloner et de caractériser le génome de ces révertants. Nous avons obtenu et analysé des clones de virus infectieux comportant les régions capside-2A et/ou VP1-2A de deux de ces révertants. La séquence de ces virus et l’analyse de virus recombinants indique que les réversions sont dues principalement à des mutations survenues dans la région 2A. Il est vraisemblable que ces mutations compensent les problèmes de « processing » des protéines précurseurs de la capside décelés dans les mutants de délétions 2A

Theilovirus --- Amyloid protein AA --- DNA Complementary

Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

MicroRNAs (miRNAs) are classes of small RNAs that modulate gene expression. Through recognition of sequence complementary target elements found in the 3’UTR of cellular mRNAs, miRNAs induce mRNA translation inhibition or catalytic mRNA degradation. In plants and insects, miRNAs can also play a role in antiviral immunity through recognition of viral mRNA or viral genomic RNA. Nevertheless, many plant and insect viruses inhibit miRNAs activity by expressing anti-silencer proteins. For example, TBSV, a Tombusvirus infecting tomato plants, expresses a protein called p19 that binds miRNAs and thus prevents target recognition. The insect virus flock house virus (FHV) expresses a protein called b2 that binds miRNAs and their precursors.
The aim of this present work was to study the effect of cellular miRNAs on Theiler’s virus replication, and to analyse whether the virus can interfere with cellular miRNAs activity.
We designed a vector allowing to test viral or cellular anti-silencer protein activity. For this purpose, we constructed a lentiviral vector carrying one of four let-7a miRNA target sequences in the 3’ non-coding region of the Renilla luciferase gene. This tool seems functional although it has to be validated definitively. Using these constructs, we failed to observe anti-silencer activity of TBSV p19 protein, in contrast to other studies that reported the activity of this protein in mammalian cells. Similarly, the flock house virus b2 protein showed only low activity which seems to be partly independent on its effect on the microRNA tested.
Next, we evaluated the impact on viral replication, of the presence of a microRNA target sequence introduced in the coding region of Theiler’s virus genome. We detected a moderate effect of microRNA on viral replication. Consistent with this observation, a theoretical analysis of the virus sequence suggests a low selection pressure toward the elimination of miRNAs target sequences in the main ORF of the viral genome. This is in contrast with other studies that observed a significant effect of microRNAs on the non-coding regions of other Picornaviruses Les microRNA (miRNA) cellulaires sont des petites molécules d’ARN dont la fonction est de réguler l’expression des gènes cellulaires. En s’hybridant par complémentarité de séquence à l’extrémité 3’UTR des ARN messager, ils peuvent induire, soit l’inhibition de la traduction de ces ARNm, soit leur dégradation. Chez les plantes et insectes, les miRNA peuvent également être impliqués dans l’immunité antivirale en s’hybridant à l’ARNm ou à l’ARN génomique d’un virus. Cependant, la plupart des virus cibles de ces miRNA cellulaires inhibent l’activité des miRNA en codant des protéines « suppresseur » des miRNA. Par exemple, le Tombusvirus TBSV, infectant les plantes de tomates, exprime une protéine appelée p19 qui lie les miRNA et les empêche de s’hybrider à leur séquence cible. De même, le Flock house virus (FHV) infectant les insectes encode une protéine appelée B2 qui séquestre les miRNA et leurs précurseurs.
L’objectif de ce mémoire était d’une part, d’étudier l’effet des miRNA endogènes sur la réplication du virus de Theiler, et d’autre part, d’analyser dans quelle mesure le virus peut interférer avec l’activité des miRNA cellulaires.
Nous avons construit un vecteur permettant de tester l’activité de protéines (virales ou cellulaires) antagonistes de la voie miRNA (activté « anti-silencer »). Pour cela, la séquence codant la luciférase de Renilla a été insérée dans un vecteur lentiviral avec, dans sa région 3‘ non-codante, la séquence cible du miRNA endogène let-7a. Cet outil semble fonctionnel bien qu’il doive encore être validé de manière définitive. A l’aide de ce vecteur, nous n’avons observé aucune activité anti-silencer de la protéine p19 du TBSV, alors que l’activité de cette protéine avait été montrée dans les cellules de mammifères. La protéine b2 du flock house virus n’a aussi montré qu’une relativement faible activité, partiellement indépendante de son effet sur le microRNA testé.
Par ailleurs, nous avons évalué l’incidence de la présence de la séquence cible d’un microRNA dans la région codante du génome du virus de Theiler. Nous avons détecté un effet modéré du microRNA sur la réplication virale. En accord avec cette observation, une analyse théorique de la séquence du virus suggère une faible pression de sélection en vue de l’élimination des séquences cibles des miRNA dans l’ORF principale du génome viral. Ceci contraste avec les effets importants, observés par d’autres études, des microRNA sur les régions non-codantes d’autres picornavirus

MicroRNAs --- Theilovirus --- Virus Replication --- Viral Proteins --- Picornaviridae