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Somatostatin --- Congresses

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Background and Objectives: Glucagon secreted by the u-cells of the islets of Langerhans is the major hyperglycemic hormone of the body. Its secretion is inhibited by glucose (G) by still unknown mechanisms. Sorne hypotheses suggest a direct effect of G on u-cells involving a decrease of the cytosolic Ca2 concentration ([Ca2+]c), and thereby of exocytosis. One possible mechanism responsible for this low [Ca2+]c might involve a closure of ATP-sensitive K+ channels (KATP channels). An indirect effect of G is also considered and would involve an inhibitory paracrine factor that would be released from cells close to u-cells, such insulin-secreting cells (p-cells) or somatostatin-secreting cells (8- cells), and that would indirectly inhibit glucagon release. The aim of my master thesis was to study the mechanisms by which G control glucagon secretion, and in particular ( 1) the rote of somatostatin in the glucagonostatic effect of G, (2) the rote of KATP channels in the control of glucagon secretion and in the glucagonostatic effect of G, (3) the existence of a direct mechanism of action of G on u-cells, and (4) the possible implication of a paracrine factor released from P-cells in the glucagonostatic effect of G. Material and Methods: Mouse islets were isolated by collagenase digestion of the pancreas and cultured ovemight in RPMI1640 medium containing 7 mM of G. For some experiments, the islets were dispersed into single cells, and then encapsulated or placed on cover-slips. Glucagon secretion was evaluated in incubation or perifusion experiments. Glucagon concentration was measured by radioimmunoassay. Results: (1) Firstly, evaluated the role of somatostatin in the glucagonostatic effect of G. To this end, compared the glucagon secretion in response to different concentrations of G between control islets and islets devoid of somatostatin paracrine influence (islets pretreated with pertussis toxin or isolated from somatostatin knockout mice). G inhibited glucagon secretion of control islets in a dose­ dependent manner (from 0 to 30 mM), with a maximal effect obtained already at around 7 mM. In the absence of somatostatin paracrine influence, G also inhibited , but less strongly, glucagon secretion. Again, the inhibition was maximal at around 7 mM G, but unlike the situation of control islets, its amplitude decreased for G concentrations > 7 mM. These results suggest that somatostatin is partially involved in the glucagonostatic effect of G, especially at G concentrations > 7 mM. (2) Secondly, 1 studied the role of KATP channels in the control of glucagon secretion. In control islets, KATP channel inhibition by tolbutamide reproduced the glucagonostatic effect of G. However, in islets lacking somatostatin paracrine influence, tolbutamide stimulated glucagon secretion. Therefore, it does not reproduce the glucagonostatic effect of glucose. These results suggest that (a) G and tolbutamide exert distinct effects, (b) the glucagonostatic effect of tolbutamide observed in control islets results from an inhibition of glucagon secretion by somatostatin secreted in response to tolbutamide, and (c) the direct effect of tolbutamide on u-cells is to stimulate glucagon release. Some authors have suggested that tolbutamide directly active Epac2 and that this effect can stimulate exocytosis by a mechanism in additional to that caused by the closure of KATP channels. Our experiments suggest that, in islet devoid of somatostatin paracrine influence, Epac2 activation is not involved in the glucagonotropic effect of tolbutamide since gliclazide, another KATP channel inhibitor without any effect on Epac2, also stimulated glucagon secretion. (3) Thirdly, to test de direct effect of G, 1 started developing the technique of measurement of glucagon secretion from dispersed u-cells. To perform perifusion experiments on these cells, we thought to encapsulate them in a polymerof alginate.Unfortunately, our results suggest that encapsulation compromises the secretion of the dispersed islet cells. We therefore resorted to the technique of glucagon secretion measurements from dispersed islet cells attached to cover-slips. ln these conditions, G stimulated insulin secretion and inhibited glucagon secretion but much Jess effectively than from whole islets. The technique should next be applied to FACS-purified u-cells. (4) Finally, to study the influence of paracrine factors released from P-cells on glucagon secretion, 1 used 2 models of P-cell death induction: the treatment of islet cells with streptozotocin, an agent supposed to specifically kill P-cells, or the use of transgenic mice (RIPrtTA­ tetDTA) in which P-cell death can be ihduced by doxycycline administration . The first mode) proved to be inadequate since streptozotocin became toxic to u-cells when used at concentrations which completely killed P-cells. By contrast, the RiprtTA-tetDTA model seemed to work properly because doxycycline administration induced diabetes. However, had not had time to evaluate the effect of this treatment on glucagon release. Le glucagon, sécrété par les cellules a des îlots de Langerhans est la principale hormone hyperglycémiante de l'organisme. Sa sécrétion est inhibée par le glucose (G) via desmécanismes toujours méconnus. Certaines hypothèses suggèrent un effet direct du G sur la cellule a impliquant une baisse de la concentration cytosolique de Ca2+ ([Ca2+]c) et, dès lors, de !'exocytose. Un des mécanismes responsables de cette baisse de [Ca2+lc impliquerait la fermeture des canaux K+ sensibles à l'ATP (canaux KATP). Un effet indirect du G est également envisagé et impliquerait un facteur paracrine inhibiteur qui serait libéré par des cellules voisines des cellules a telles que les cellules à insuline (cellules P) ou à somatostatine (cellules o) et qui inhiberait la sécrétion de glucagon. L'objectif de mon mémoire a été d'étudier les mécanismes par lesquels le G contrôle la sécrétion de glucagon, et en particu lier, (1) le rôle de la somatostatine dans l'effet glucagonostatique du G, (2) le rôle des canaux KATP dans le contrôle de la sécrétion de glucagon et dans l'effet glucagonostatique du G, (3) l'existence d'un mécanisme d'action direct du G sur les cellules a et (4) l'implication possible d'un facteur paracrine issu des cellules p dans l'effet glucagonostatique du G.Matériel et méthodes : Des îlots de souris ont été isolés par digestion à la collagénase du pancréas et cultivés pendant une nuit dans du milieu RPMI I640 contenant 7 mM de G. Pour certaines expériences, les îlots ont été dispersés en cellules isolées, puis encapsulées ou mises sur couvre-objet. La sécrétion de glucagon a été évaluée en périfusion ou incubation. La concentration de glucagon a été mesurée par dosage compétitif radio-immunologique ("radioimmunoassay" ou RIA).Résultats : (1) Dans un premier temps, j 'ai évalué le rôle de la somatostatine dans l'effet glucagonostatique du G. A cette fin, j'ai comparé la sécrétion de glucagon en réponse à différentes concentrations du G à partir d'îlots contrôle ou dépourvus d'influence paracrine de la somatostatine (îlots prétraités à la toxine pertussique ou isolés à partir de souris KO pour la somatostatine). Le G inhibe de façon dose-dépendante (de 0 à 30 mM) la sécrétion de glucagon d'îlots contrôle avec un effet maximal obtenu déjà à environ 7 mM. En l 'absence d'influence paracrine de la somatostatine, le G inhibe aussi, mais moins puissamment, la sécrétion de glucagon. L'inhibition est à nouveau maximale vers 7 mM de G, mais contrairement aux îlots contrôle, elle diminue en amplitude aux concentrations de G > 7 mM. Ces résultats suggèrent que la somatostatine est partiellement impliquée dans l'effet glucagonostatique du G surtout aux concentrations de G > 7 mM. (2) Dans un second temps, je me suis intéressée au rôle tenu par les canaux KATP dans le contrôle de la sécrétion de glucagon. Dans des îlots contrôle, l'inhibition des canaux KATP par le tolbutamide reproduit l'effet glucagonostatique du G. Toutefois, dans des îlots dépourvus d'influence paracrine de la somatostatine, le tolbutamide stimule la sécrétion de glucagon. Il ne reproduit dès lors pas l'effet glucagonostatique du G. Ces résultats suggèrent que (a) le G et le tolbutamide exercent des effets distincts, (b) l'effet glucagonostatique du tolbutamide observé dans des îlots contrôle résulte d'une inhibition de la sécrétion de glucagon par la somatostatine sécrétée en réponse au tolbutamide et (c) l'effet direct du tolbutamide sur la cellule a est de stimuler la sécrétion de glucagon. Certains auteurs ont suggéré que le tolbutamide active directement Epac2 et que cet effet puisse stimuler l'exocytose par un mécanisme supplémentaire à celui causé par la fermeture des canaux K ATP· Nos expériences suggèrent que, dans des ilots dépourvus d'influence paracrine de la somatostatine, l'activation de Epac2 n'est pas impliquée dans l'effet glucagonotrope du tolbutamide car le gliclazide, un autre inhibiteur des canaux KATP dépourvu d'effet sur Epac2, stimule également la sécrétion de glucagon . (3) Troisièmement, afin de tester l'effet direct du G, j'ai commencé à mettre au point la technique de mesure de sécrétion de glucagon à partir de cellules a dispersées. Pour pouvoir réaliser des expériences de périfusion sur ces cellules, nous avons pensé à les encapsuler dans un polymère d'alginate. Malheureusement, nos résultats suggèrent que l'encapsulation compromet la sécrétion des cellules dispersées. Nous avons donc eu recours à la technique de mesure de sécrétion à partir de cellules d'îlots dispersées et attachées sur couvre-objet. Dans ces conditions, le G stimule la sécrétion d'insuline et inhibe celle de glucagon mais de façon beaucoup moins efficace qu'à partir d'îlots. La technique devra encore être appliquée aux cellules a purifiées par FACS. (4) Enfin, pour étudier l'influence de facteurs paracrines issus de cellules p sur la sécrétion de glucagon, j'ai eu recours à 2 modèles d'induction de mort des cellules p:le traitement de cellules d'îlots avec la streptozotocine, un agent censé tuer spécifiquement les cellules p, ou l'utilisation de souris transgéniques (RIPrt TA-tetDTA) chez lesquelles la mort des cellules p peut être induite par administration de doxycycline. Le premier modèle s'avère inadéquat car la streptozotocine devient toxique pour les cellules a lorsqu'elle est utilisée aux concentrations qui tuent totalement les cellules p. Par contre, le modèle de souris RIPrtTA-tetDTA semble fonctionner puisque l'administration de doxycycline induit le diabète. Toutefois, je n'ai pas eu le temps d'évaluer l'effet de ce traitement sur la sécrétion de glucagon.

Somatostatin --- KATP Channels --- Glucose

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Immunization --- Somatostatin --- Cattle

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Prolactin --- Somatomedins --- Somatostatin --- Growth Hormone

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Cattle --- Somatostatin --- Immunization --- Immune response --- Composant sanguin --- Composant sanguin