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Ce travail vise à caractériser l’ensemble du microbiote pulmonaire bactérien en cas de maladie respiratoire infectieuse. Cette maladie présente une étiologie complexe comprenant beaucoup d’agents étiologiques dont des virus et des bactéries parmi lesquels on retrouve des agents connus et d’autres émergents. La pathogénie de la maladie respiratoire infectieuse canine est complexe puisque les différents agents étiologiques agissent ensemble selon divers moyens. Bien souvent, ce sont les virus qui préparent le terrain et le fragilisent permettant une surinfection bactérienne. Cependant, il existe des moyens de prévention contre cette maladie qui permettent de protéger le chien vacciné contre certains agents étiologiques (le virus parainfluenza canin, l’adénovirus canin de type 2 et l’herpèsvirus canin de type 1et Bordetella bronchiseptica). Malgré les vaccins disponibles, on observe une morbidité importante puisque cette maladie reste très contagieuse et l’immunité contre Bordetella bronchiseptica est courte, mais surtout, il y a d’autres agents étiologiques intervenants. 
Dix-huit chiens souffrants de maladie respiratoire infectieuse depuis un mois voire plus ont été étudiés, sauf pour un chien qui souffrait de la maladie seulement depuis quelques jours. Ces chiens ont été présentés à la Clinique Vétérinaire Universitaire de Liège entre 2014 et 2018. Ils ont tous subis une endoscopie respiratoire pendant laquelle un lavage broncho-alvéolaire a été réalisé. Ces échantillons ont été analysés par métagénétique en étudiant la séquence du fragment V1-V3 du gène codant pour l’ARN ribosomique 16S. Les résultats ont permis de mettre en évidence 224 groupes de séquences différentes avec une dominance de quatre espèces bactériennes : Bordetella bronchiseptica, Mycoplasma cynos, Mycoplasma sp. (espèce non décrite) et Pseudomonas reidholzensis/entomophila/putida. Certains chiens ont montré un écosystème dominé par une ou deux populations, d’autres un microbiote plus complexe. Des effectifs plus importants seraient nécessaires pour expliquer les causes et conséquences de ces différences mais cette approche diagnostique présente un grand potentiel pour améliorer la prise en charge de ces affections.

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Les entérobactéries comme E. coli, K. pneumoniae et S. enterica sont fréquemment la cible thérapeutique d’antibiotiques et notamment ceux de la famille des ß-lactamines tant en médecine humaine que vétérinaire. Depuis le début de l’utilisation de cette famille d’antibiotiques, ces organismes ont développé des mécanismes de résistance contre ces molécules, notamment par l’acquisition de gènes codant pour des ß-lactamases. Ces enzymes inhibent un nombre croissant de ß-lactames au fil du temps et nous arrivons dans une situation où il ne reste que peu de molécules encore actives face à certaines souches bactériennes, le risque étant de se retrouver dépourvu de toute arme contre des agents bactériens initialement maîtrisés par ces antibiotiques. Dans une optique globale de la santé, humaine et animale, des solutions sont proposées et appliquées afin de ralentir cette tendance et de prolonger notre vision d’avenir concernant l’antibiothérapie.

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Ce travail a pour but, dans un premier temps, de réaliser une revue bibliographique des antibiorésistances portées par des entérobactéries isolées chez des reptiles et de déterminer si ces espèces animales sont régulièrement porteuses de souches résistantes et dans un second temps, il a pour but d’évaluer les profils de résistance de souches d’Escherichia coli isolées en Belgique via une mise en pratique en laboratoire. Les antibiorésistances, portées par différents genres d’entérobactéries isolés chez des reptiles, ont été recherchées en réalisant une revue de la bibliographie. Escherichia coli est régulièrement détectée chez les reptiles (+- 70%), les résistances de cette bactérie sont, en majorité, des résistances envers les bêta-lactamines, le triméthoprime-sulfaméthoxazole, la tétracycline, le chloramphénicol et les quinolones. Différentes sous-espèces du genre Salmonella sont typiquement mises en évidence chez les reptiles, la sous-espèce enterica se rencontre aussi chez ceux-ci. Le profil d’antibiorésistances des souches de Salmonella varie selon les études. Le genre Klebsiella est en outre retrouvé chez les reptiles, le profil d’antibiorésistance de ces bactéries est assez similaire au cas d’E. coli. Les Morganellaceae (anciennement classée comme Enterobacteriaceae) sont régulièrement isolées chez ces derniers. De haut taux de résistances aux bêta-lactamines, au nitrofurane, à la tétracycline et aux aminoglycosides sont obtenus chez ces dernières. La présence d’antibiorésistances est mise en évidence chez les reptiles sauvages ; un lien entre cette présence et la pollution du milieu semble exister. Les profils de résistance de 50 souches d’E. coli isolées chez des reptiles en 2009 en Belgique ont été évalués en laboratoire. Les analyses démontrent que les souches sont pour la plupart sensibles aux 16 antibiotiques testés, seul 12 souches sont porteuses de résistances. Les plus hauts pourcentages de souches résistantes sont obtenus pour l’amoxicilline (24%), la tétracycline (16%), le triméthoprime-sulfaméthoxazole (10%), la ciprofloxacine (8%) et l’enrofloxacine (8%). On remarque qu’aucune souche n’est porteuse de gènes de BLSE (bêta-lactamase à spectre étendu). Les résultats obtenus sont assez rassurants mais il serait intéressant de comparer le profil de résistances de souches récoltées en 2021 en Belgique avec les résultats obtenus dans ce travail.

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The studies of the bacterial communities are increasingly popular. Thanks to the continuous decrease in price of NGS services, curiosity is the limit. It is reflected in the diversity of the metabarcoding data available. Recently a collaborative Earth Microbiome Project had begun a creation of Earth’s multiscale microbial diversity catalogue unifying the effort of almost 100 independent studies for standardization of the protocol for bacterial communities analyses. However, in the public databases there is a substantial amount of the metabarcoding data that were generated throughout the years with the use of different sequencing primers targeting different hypervariable regions. 
The information about bacterial communities compositions accumulated in those metabarcoding samples could serve e.g. for identification of the origin of the sample. This work aims at establishing a base process for combining the analysis of the metabarcoding data obtained using various protocols. In the process of selection, out of over a million sequencing runs, 1567 individually processed paired-end reads samples were merged into 45 fine-scaled categories falling into four general datasets: animal-, animal-gut-, environment-, and plant-related. Next, they were processed using popular QIIME2 software without OTU clustering. Three general databases containing 16S rRNA taxonomic information, and their efficacy at five taxonomic ranks, have been tested in order to optimize the taxonomic identification of amplicon sequence variants. The above-mentioned datasets were tested for classification accuracy using two different dimensionality reduction techniques, Principal Component Analysis and Linear Discriminant Analysis applied on the similarity/dissimilarity matrices obtained separetly from an abundance and presence/absence matrices. The aptitude of machine learning in establishing the taxonomic-based classification of the sample sources has been tested with four different algorithms, radial SVM, Naive Bayes, Random Forest and k-Nearest Neighbours. The LDA transformed similarity matrix created at Order rank provided the best and most confident classification with corrected accuracy of 97.6%. Additionally, to examine whether there exist taxonomic relationships among the microorganisms detected in the aforementioned studies, the association rule learning algorithms ‘Apriori’ has been utilized. Number of co-occurrences of microorganisms on different taxonomic ranks was detected and several different taxa forming highly connected nodes were observed. Those taxa can be regarded as putative keystone taxa and considered for further investigation in different niches.

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Le virus de la varicelle et du zona (VZV ou HHV-3) est un Alphaherpesvirus humain à l’origine de deux pathologies, la varicelle (chickenpox) et le zona (shingles). La propagation du VZV est assez différente de celle d’HSV-1 qui génère beaucoup de particules virales infectieuses en suspension dans le surnageant. Le VZV, lui, se propage presqu’exclusivement par contact cellule à cellule, et provoque une fusion massive des cellules entre elles, menant in vivo comme in vitro à l’apparition de cellules géantes plurinucléées, les syncytia. Ce processus est encore mal compris, mais fait intervenir les mêmes protéines que celles impliquées dans l’entrée du virus, la glycoprotéine gB, comportant des boucles de fusion caractéristiques qui doit être activée par le complexe gH/gL, mais aussi la glycoprotéine gE qui a été montrée très importante pour la propagation virale notamment via un motif d’interaction avec la protéine cellulaire IDE (insulin-degrading enzyme) et un motif d’interaction avec gI. L’ORF9p, la protéine tégumentaire majeure du VZV, intervient dans l’enveloppement secondaire et interagit avec le complexe cellulaire AP-1 qui régit le trafic protéique et vésiculaire entre la partie trans de l’appareil de Golgi et l’endosome de recyclage. Des études menées dans notre laboratoire ont permis de démontrer qu’un virus portant une mutation ponctuelle sur ORF9p (L231A), empêchant sa liaison avec AP-1, présente un gros défaut de croissance et des foyers d’infection totalement dépourvus de syncytium. Après une dizaine de passages en culture, ce mutant se caractérise par une réversion phénotypique avec une réapparition des syncytia. Le but de travail est d’étudier le rôle d’ORF9p dans la fusion cellule-cellule pour permettre la propagation du VZV dans les tissus. 

Une analyse des foyers viraux en microscopie à fluorescence a montré que la mutation ORF9p-F181A diminue la réplication virale et la fusion cellule-cellule, à l’inverse de la mutation F181W qui la favorise. Ensuite, des expériences en co-immunoprécipitation ont permis de démontrer que la mutation ORF9p-F181A perturbe la liaison d’ORF9p avec gE et gH, mais aussi la liaison entre gB et gH. Enfin, des immunofluorescences ont permis de montrer que la mutation F181A provoque un défaut d’expression des glycoprotéines en surface des foyers viraux. Nous avons également observé, lorsque les mutants de la protéine ORF9p sont maintenus pendant un grand nombre de passages en culture, une réversion phénotypique, avec réapparition de syncytia pour le mutant ORF9p-F181A. Des analyses par séquençage à haut débit ont montré que des mutations spontanées compensatoires apparaissent dans la séquence codant pour les glycoprotéines gE, gB et gH. 

En conclusion, ORF9p est une protéine du VZV très importante qui intervient dans le trafficking des glycoprotéines permettant, in fine, la fusion cellule-cellule.

VZV virus ORF9p --- Sciences du vivant > Microbiologie