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Molecular cloning --- Polymerase chain reaction --- Reverse transcriptase

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Hypercatabolic states caused by injury such as burns, sepsis, and trauma are characterized by loss of lean body mass, particularly muscle, which is associated with increased morbidity and mortality. These Hypercatabolic states are characterized by increased production of cytokines and glucocorticoids and by low muscular and circulating IGF-I concentrations. Given its anabolitic and anticatabolic actions, this growth factor has been proposed to prevent loss of muscular body mass caused by Hypercatabolic states. However, many works show that the anticatabolic action of IGF-I could be inhibited in many models of Hypercatabolic states.
Our study investigated in a muscle cell line whether proinflammatory cytokines and glucocorticoids might inhibit the antiproteolytic action of IGF-I. We showed that inflammatory cytokines and glucocorticoids don’t inhibit the antiproteolytic action of IGF-I. We also showed that IGF-I exerts its antiproteolytic action through the phosphatidylinositol-3 kinase pathway. Most of the basal proteolysis in the muscle cell line is mediated by activation of the ubiquitin-proteasom system. The antiproteolytic action of IGF-I partially results from inhibition of this system but also of other proteolytic systems non investigated in our study.
To define the genes of the ubiquitin-proteasom system responsible for the muscular antiproteolytic action of IGF-I, we studied the regulation of several genes of this system after fasting with or without IGF-1 administration. We showed that fasting induces especially some ubiquitin-ligases recently identified and known as Mafbx and Atrogin-1. We also showed that IGF-I injection strongly inhibits the induction of these genes by fasting. These data suggest therefore that the reduction of circulating IGF-I concentrations during fasting may contribute to the induction of these ubiquitin-ligases and probably to the muscular proteolysis caused by fasting Les états hypercataboliques se caractérisent par une perte importante de masse maigre et notamment de muscle, corrélé au risque de morbidité et de mortalité. Ces états hypercataboliques s’accompagnent presque toujours de taux élevés de cytokines pro inflammatoires et de glucocorticoïdes et d’une diminution des concentrations circulantes et musculaires d’IGF-I, un facteur de croissance doué de propriétés anaboliques et anti cataboliques au niveau du muscle. L’administration d’IGF-I pourrait être utilisée pour freiner la perte de masse musculaire dans ces situations. Cependant, plusieurs travaux montrent que l’action anti catabolique de l’IGF-I est inhibée dans plusieurs modèles d’états hypercataboliques.
Notre travail a cherché à savoir si les cytokines pro inflammatoires et les glucocorticoïdes sont capables de bloquer l’action anti protéolytique de l’IGF-I dans un modèle de cellules musculaires en culture. Nos données montrent que l’action anti protéolytique de l’IGF-I in vitro n’est pas bloquée par les cytokines pro inflammatoires et les glucocorticoïdes. Nous montrons que l’IGF-I exerce son effet anti protéolytique en utilisant la voie de la phosphatidylinositol-3 kinase. Alors que la protéolyse de base est due à l’activation du système protéolytique ubiquitine-protéasome-ATP-dépendant, nous montrons que l’effet anti protéolytique de l’IGF-I résulte en partie de l’inhibition de ce système, mais aussi d’autres systèmes protéolytiques non investigués dans notre étude.
Afin de définir les gènes du système ubiquitine-protéasome qui sont responsables de l’action anti protéolytique de l’IGF au niveau musculaire, nous avons étudié la régulation de plusieurs gènes de ce système en réponse au jeûne avec ou sans administration d’IGF-I. Nous montrons que le jeûne chez le rat induit spécifiquement certaines ubiquitine-ligases récemment décrites (Mafbx et atrogine-1). Nous montrons également que l’injection d’IGF-I atténue fortement l’induction de ces gènes par le jeûne. Ces données suggèrent donc que la réduction des taux d’IGF-I circulants au cours du jeûne contribue à l’induction de ces ubiquitine-ligases et donc probablement à la protéolyse observée en réponse au jeûne

Insulin-Like Growth Factor I --- Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction

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The Human Immodeficiency Viruses type 1 and 2 (HIV-1 and HIV-2) are both causing AIDS (Acquired ImmunoDeficiency Syndrome). However, HIV-2 has several discrepancies compared to HIV-1 : the disease progression is slower, the viremia is weaker, and the efficiency of transmission is lower. This explains in part why that virus is mainly present in West Africa and did not caused a pandemic as HIV-1. Genetic differences are responsible for structural variations in the proteins that are targeted by the antiretroviral drugs, which were developed against HIV-1. Therefore HIV-2 is naturally resistant to some of these molecules. The analysis of the available data in the literature, as well as the observations made form the patients of Belgian and Luxembourg, allowed us to propose guidelines for the treatment of HIV-2 infection. The antiretroviral combination should include protease inhibitors (PI) and nucleosidic reverse transcriptase inhibitors (NRTI). The most appropriated PIs seem to be lopinavir, saquinavir and darunavir Les virus de l’immunodéficience humaine de type 1 et 2 (VIH-1 et VIH-2) sont deux virus responsables du développement du SIDA (Syndrome d’ImmunoDéficience Acquise). Cependant, le VIH-2 présente plusieurs particularités qui le différencient du virus de type 1 : l’évolution de l’infection est en général plus lente, la virémie est plus faible, et l’efficacité de transmission est moindre. Ceci montre en partie pourquoi ce virus est présent majoritairement en Afrique de l’Ouest et n’a pas causé de pandémie comme le VIH-1. Des différences génétiques sont responsables de variations structurelles des protéines visées par les thérapies antirétrovirales développées contre le VIH-1. Dès lors, le VIH-2 est naturellement résistant à certaines molécules. L’analyse des données de la littérature, ainsi que les observations menées chez les patients suivis en Belgique et au Luxembourg, ont permis d’élaborer des recommandations pour le traitement de l’infection VIH-2. L’association de molécules antirétrovirales devrait inclure des inhibiteurs de protéase (IP) et des inhibiteurs nucléosidiques de la transcriptase inverse. Les IP les plus appropriés semblent être le lopinavir, le saquinavir et la darunavir

Acquired Immunodeficiency Syndrome --- HIV Reverse Transcriptase --- HIV Protease Inhibitors

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HIV type 2 is the second immunodeficiency virus to infect humans and like HIV-1, the virus is known to cause AIDS. The activity of current antiretroviral drugs is not well established in HIV-2- infected patients and data available on the development of drug resistance in vivo are scare.
The first aim of this work concerns the set up of a method inducing the emergence of resistance mutations. Two strains ROD and EHO, belonging respectively to subtype A and B, are used to infect H9 cell culture in the presence of nucleoside reverse transcriptase inhibitor. Three molecules are tested: ziduvudine (AZT), lamivudine (3TC) and abacavir (ABC). In parallel, a PCR amplification was developed to sequence the RT gene of cultured strains and clinical samples.
The drug concentration used in culture was chosen with regard to the IC50 determined by a viability assay; the MTT test on MT-4 cells. This assay also enables us to determine the sensitivity of a mutant strain to a drug. We have obtained EHO and ROD virus bearing the M184V mutation known to induce resistance to lamivudine in HIV-1.
No mutation was detected with AZT , even by multiplying more than 5000 times its concentration. On the basis of kinetic assays, no AZT activity was observed in H9 cells.
The sequencing of several HIV-2 infected patients confirmed that PCR with the primers specific for ROD, belonging to the most frequently subtype, is applicable to clinical samples to a certain extent. The genotype of two patients treated with Trizivir®(AZT-3TC-ABC) showed primary M184V and Q151M mutations, known in HIV-1 and already described among HIV-2 infected patients, and also some others mutations previously undescribed HIV type 2 est le second virus de l’immunodéficience à infecter des humains à l’instar du virus HIV-1, il est associé au syndrome d’immunodéficience acquise (SIDA). L’activité et l’efficacité des antirétroviraux ne sont pas encore clairement établies chez des patients infectés par le deuxième type de virus HIV. De même, des données concernant l’émergence, in vivo, de mutations de résistances restent rares.
Le premier objectif de ce travail consiste à développer une méthode induisant l’apparition de mutations conférant une résistance au virus HIV2. Deux souches virales, ROD et EHO respectivement de sous-type A et B, sont utilisées pour infecter des cellules H9 en ªªªªsont testés : la zidovudine (AZT), la lamivudine (3tc) et l’abacavir (ABC). En parallèle, une réaction de PCR erst mise au point afin de permettre la séquençage de gène de la transcriptase inverse des souches virales issues des cultures cellulaires et celles isolées à partir d’échantillons cliniques.
La concentration de médicaments utilisée en culture correspond à l’IC50, déterminée par un test de viabilité cellulaire ; le test MTT réalisé sur des cellules MT -4. Cette technique permet également de déterminer la sensibilité d’une souche mutée vis-à-vis d’un antirétroviral.
Deux souches virales ROD et EHO arborant la mutation M184V ont été obtenues. Cette mutation est connue pour conférer au virus HIV-1 une résistance à la lamivudine. Aucune mutation spécifique de la zidovudine n’a pu être détectée, même en multipliant plus de 5000 fois sa concentration. Sur base d’un test cinétique, aucune activité de l’AZT n’a pu être observée chez des cellules H9 infectées.
Le séquençage de plusieurs patients infectés par HIV-2 a confirmé que l’utilisation d’amorces spécifiques à ROD, appartenant au sous-type le plus fréquemment rencontré, est applicable dans une certaine mesure à des échantillons cliniques. Le génotypage d’un patient traité avec du Trizivir® (AZT-3TC-ABC) a pu mettre en évidence les mutations primaires M184V et Q151M, connues pour HIV-1 et déjà décrites chez des patients HIV-2 positifs, ainsi que d’autres mutations inconnues jusqu’à présent

reverse transcriptase, Human immunodeficiency virus 2 --- Mutation --- Drug Resistance, Viral

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Protease inhibitors (PIs) and non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors (NNRTIs) belong to two classes of drugs which have, since their introduction on the market, significantly reduced the morbidity and mortality related to the HIV infection. Nevertheless, the rate of therapeutic failure remains high, and the use of these drugs is still associated with important toxicity episodes. The use of therapeutic drug monitoring, combined with a pharmacogenetic approach, could considerably improve the efficacy of antiretroviral treatments (ARV). However, this approach requires the use of reliable dosage methods in biological media. Therefore, we first developed and validated two analytical methods for the simultaneous quantification of 10 ARV (8 PIs [IDV, SQV, NFV, APV, ATZ, RTV, LPV, TPV] and 2 NNRTIs [NVP and EFV]) in plasma and lymphocytes, the site of therapeutic action of these drugs. A method using liquid chromatography coupled with an UV detector (UPLC-DAD) was developed and covered plasmatic concentrations ranging from 25 to 10.000 µg/L for all ARV, except the TPV (1.875 to 75.000 µg/L). For ARV intralymphocytic dosages for concentrations ranging from 0,5 to 100 µg/L of cell extract, a liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) method was validated. However, this method must still be improved for some compounds before being used in daily clinical practice. Pharmacogenetics could also play an essential role in the individualization of treatments. The second objective of this work was to investigate the impact of genetic polymorphisms of the P-glycoprotein (P-gp), protein involved in the transport of PIs, as well as biotransformation enzymes (CYP3A5 and CYP2B6) on the intracellular accumulation of some PIs and NNRTIs. First, it appears that the ABCB1 1199G>A polymorphism affects the affinity of the P-gp for its substrates and is associated with an enhanced cellular efflux of some IPs (ATZ, RTV). In addition, our results suggest that the activity of the P-gp towards NFV and Rh123 seems to be affected by the ABCB1 3435C>T polymorphism. Also, we showed that the polymorphism CYP3A5*3 could be important to explain a part of the interindividual variability observed in the intralymphocytic metabolism of SQV. Finally, we observed a variation in the efllux and the accumulation of some ARV (ATZ, RTV and NVP) among two cell lines (H9 and MT4) characterized by differences in their P-gp activity. In conclusion, this work provides the possibility to quantify PIs and NNRTIs in plasma and lymphocytes ; and highlights some genetic polymorphisms likely to explain the interindividual variability observed in the pharmacokinetics of ARV. Les inhibiteurs de la protéase (IPs) et les inhibiteurs non-nucléosidiques de la transcriptase inverse (NNRTIs) appartiennent à deux classes de médicaments qui ont, depuis leur introduction sur le marché, permis une réduction significative de la morbidité de la mortalité liées au VIH. Cependant, le taux d’échec thérapeutique demeure élevé, et l’usage de ces médicaments reste associé à d’importants phénomènes de toxicité. L’utilisation du monitoring thérapeutique, combinée à une approche pharmacogénomique, pourrait considérablement améliorer l’efficacité des traitements antirétroviraux (ARV). Cette approche nécessite toutefois l’utilisation de méthodes de dosage fiables dans les milieux biologiques. Ainsi, dans un premier temps, nous avons développé et validé deux méthodes analytiques pour le dosage simultané de 10 ARV (8 IPs [IDV, SQV, NFV, APV, ATZ, RTV, LPV, TPV] et 2 NNRTIs [NVP et EFV]) dans le plasma et dans les lymphocytes, sites d’action de ces médicaments. Une méthode de chromatographie liquide couplée à un détecteur UV (UPLC-DAD) a été développée pour les dosages plasmatiques sur une gamme de concentrations de 25 à 10.000µg/L pour tous les ARV, excepté le TPV (1.875 à 75.000 µg/L). Pour les dosages intralymphocytaires des ARV sur une gamme de concentrations de 0,5 à 100 µg/L, une méthode de chromatographie liquide couplée à un spectromètre de masse en tandem (LC-MS/MS) a été validée. Cette méthode doit cependant être améliorée pour certains des composés avant de pouvoir être utilisée en routine clinique. La pharmacogénomique pourrait également jouer un rôle essentiel dans l’individualisation des traitements. Le second objectif de ce travail était d’investiguer l’impact de polymorphismes génétiques de la P-gp, protéine impliquée dans le transport des IPs, ainsi que d’enzymes de biotransformation (CYP3A5 et CYP2B6) sur l’accumulation intracellulaire de certains IPs et NNRTIs. Il apparaît tout d’abord que le polymorphisme ABCB1 1199G>A affecte l’affinité de la P-gp pour ses substrats et est associé à un efflux cellulaire accru de certains IPs (ATZ, RTV). Par ailleurs, nos résultats suggèrent que l’activité de la P-gp vis-à-vis du NFV et de la Rh123 semble être affectée négativement par le polymorphisme ABCB1 3435C>T. Aussi, nous avons montré que le polymorphisme CYP3A5*3 pourrait être important pour expliquer la variabilité interindividuelle observée dans le métabolisme intralymphocytaire du SQV. Enfin, nous avons observé une variation dans l’efflux et l’accumulation de certains ARV (ATZ, RTV et NVP) au sein de deux lignées cellulaires (H9 et MT4) présentant une activité de la P-gp différente. Ce mémoire offre donc la possibilité de doser les IPs et les NNRTIs dans le plasma et les lymphocytes ; et met en évidence certains polymorphismes génétiques susceptibles d’expliquer la variabilité interindividuelle observée dans la pharmacocinétique des ARV.

Protease Inhibitors --- P-Glycoprotein --- Cytochrome P-450 --- Lymphocytes --- Plasma --- HIV Reverse Transcriptase