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The discovery of the β3-adrenoceptor and its atypical properties in several tissues has promoted the development of a new class of drugs able to interact specifically with this receptor. In the cardiovascular system, stimulation of this receptor induces negative inotropic effects on the heart and relaxant effects on the vessels.
Nebivolol is a third generation β-blocker that displays some vasodilating properties. This relaxant effect in not due to the β1-antagonistic activity and may be explained by the stimulation of the β3-adrenoceptors. We tested this hypothesis in several experimental models.
First, the vasorelaxant effect evoked by nebivolol was studied on rat microarteries where we have shown a NO-dependent vasorelaxation mediated by β3-adrenoceptors. In human microarteries, an endothelium-dependent and β1, β2-independent vasodilatation was confirmed.
The intracellular pathways involved in the β3-adrenoceptor coupling were characterized in endothelial cells expressing both eNOS and the β3-adrenoceptor. Because human endothelial cells displayed phenotypic instability (for cloned HUVECs) or insufficient yield (for primary isolated HUVECs), we chose bovine aortic endothelial cells for our experiments. A production of NO evoked by nebivolol was demonstrated in this cell type using a NO-specific sensor.
Two potential eNOS activation pathways mediated by β3-adrenoceptors were studied in these cells: changes in the intracellular Ca2+ and the phosphorylation of Ser 1177 of the eNOS protein, by using a fluorescent probe binding Ca2+ specifically or by immunodetection of the phosphorylated protein, respectively. A nebivolol-induced Ca2+ increase mediated by β3-adrenoceptor was observed whereas no significant changes in phosphorylation signal was detected, suggesting that the Ca2+ increase is the main activation mechanism evoked by nebivolol.
The nebivolol-induced Ca2+ increase was insensitive to a treatment of the cells with PTX suggesting a coupling of the β3-adrenoceptors to G-protein other than Gi/o protein.
In conclusion, we showed that nebivolol induces a NO-mediated vasorelaxation and NO production in endothelial cells. The eNOS activation pathway probably involved mainly an intracellular Ca2+ increase mediated by β3-adrenoceptor stimulation. This mechanism of activation was Gi/o-independent La découverte du récepteur β3- adrénergiques et des ses propriétés atypiques dans plusieurs tissues, notamment ses propriétés lipolytiques, l’ont désigné comme cible thérapeutique potentielle dans le traitement de l’obésité et du diabète non insulino-dépendant. Considérant le rôle majeur des catécholamines dans le contrôle du système cardio-vasculaire, il s’avère primordial de déterminer le profil d’expression ainsi que le rôle fonctionnel de ce répéteur sur l’homéostasie cardio-circulatoire. Ce travail visa à déterminer un modèle expérimental qui permettra l’étude des voies signalétiques liées à la stimulation du récepteur β3-adrénergique dans l’endothélium vasculaire et d’appliquer ce modèle à la caractérisation de l’action vasodilatatrice du nébivolol.
Nous avons montré que le nébivolol, un β1-bloquant pourvu de propriétés vasodilatatrices non explicables par une action sur les récepteurs β1-adrénergiques est capable d’induire une relaxation de microartères coronaires. Dans une modèle de microvaisseaux coronaires de rat, nous avons observé que cette relaxation est médiée par le récepteur β3-adrénergique et implique l’activation de la voie NOS/NO. Dans la microcirculation coronaire humaine, nous avons confirmé que la relaxation induite par le nébivolol est dépendante de la présence d’un endothélium fonctionnel et n’implique pas les récepteurs β1 ou β2-adrénergiques.
Pour caractériser les voies biochimiques activées par la stimulation du récepteur β3 de l’endothélium vasculaire, nous avons choisi un modèle cellulaire exprimant à la fois, le récepteur β3 et eNOS dont nous avons montré l’implication précédemment. Les cellules endothéliales d’origine humaine montrant une trop grande instabilité phénotypique (lignée cellulaire) ou un trop faible rendement (culture primaire), nous avons choisi in modèle de cellules endothéliales issues d’aortes bovines. Une première expérience sur ces cellules fut d’étudier la production de No stimulée par le nébivolol au moyen d’une électrode conçue pour détecter spécifiquement ce gaz. Nous avons pu montrer que le nébivolol induit effectivement une production de NO par eNOS dans les cellules endothéliales.
nous avons étudié le mode d’activation de eNOS lors de la stimulation des récepteurs β3-adrénergiques à savoir : l’augmentation de la concentration cytosolique de calcium et/ou la phosphorylation de l’enzyme. Pour cela, nous avons utilisé une sonde fluorescente capable de lier le Ca++ dans le cytosol : le Fura-2. Nous avons observé que le nébivolol induit une augmentation du Ca++ cytosolique successive à l’activation du récepteur β3-adrénergique. Dans un second temps, nous avons mesuré les variations de l’état de phosphorylation de eNOS sous l’action du nébivolol. Les immunodétections de la forme phosphorylée de eNOS n’’ont montré aucune signal significatif quand les cellules sont traitées avec le nébivolol suggérant que l’activation de eNOS est uniquement dépendante des variations de calcium intracellulaire. Par ailleurs, l’augmentation de Ca++ induite par le nébivolol n’est pas influencée par un pré-traitement des cellules avec de la PTX (inhibiteur de Gi/o) et ne semble donc pas dépendre d’un couplage du récepteur β3-adrénergique à la protéine Gi/o.
Ces résultats nous ont amenés à conclure que le nébivolol exerce ses effets vasorelaxant en induisant une production de NO par eNOS dans les cellules endothéliales. L’activation de eNOS se fait vraisemblablement par une augmentation du Ca++ intracellulaire médiée par la stimulation du récepteur β3-adrénergique. Ce mécanisme ne dépend pas d’un couplage du récepteur à la protéine Gi/o

Endothelium --- Receptors, Adrenergic, beta

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Polymorphism, Genetic --- Receptors, Adrenergic, beta-1 --- Receptors, Adrenergic, beta-2

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Receptors, Adrenergic, beta-3 - therapeutic use --- Ventricular Remodeling

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Renin --- Kidney --- Receptors, Adrenergic, beta --- Receptors, Adrenergic, alpha --- secretion --- drug effects --- metabolism

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Dietary Fats --- Fatty Acids, Unsaturated --- Receptors, Adrenergic, beta --- Lung Diseases, Obstructive --- pharmacology --- physiology