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UCLouvain (4)


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2005 (1)

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Contribution à l'étude des canaux potassiques voltage-dépendants dans les cellules musculaires lisses de l'artère mésentérique de rat
Authors: --- --- ---
Year: 2005 Publisher: Bruxelles: UCL,

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Abstract

In this work, we characterized the potassium current in three types of preparations : vascular smooth muscle cells (VSMCs) isolated enzymatically from the mesenteric artery of Wistar and Wistar Kyoto (WKY) rats, and cells in primary culture obtained from the Wistar mesenteric artery by the explant procedure. We tried to determine the involvement of three isoforms of the voltage-dependent potassium channel in this potassium current : Kν1.5, Kν2.1 and Kν3.4.
In a first step, we had to demonstrate these Kν isoforms in the tissue and cells examined. We used two techniques : Western Blotting, to investigate protein expression, and RT-PCR, to analyze mRNA levels. Semi-quantitative RT-PCR was more successful than Western Blotting, allowing us to conclude thath : (1) the three isoforms, but mainly Kν2.1, were expressed in enzymatically isolated WSMCs, whereas only Kν2.1 was detectable in explant-derived cultured cells ; (2) the expression level of Kν1.5 was distinctly higher on WKY than in Wistar rats.
The patch-clamp technique allowed us t measure the global electrophysiological activity of Kν channels in enzymatically isolated cells (Wistar and WKY) and cultured cells (explant). We analyzed the current intensity (in Ca-free solution) and the degree of inactivation as a function of voltage. Our results indicate that : (1) the Kν density was distinctly higher in VSMCs from WKY compared to those from Wistar rats ; (2à Kν current inactivated at more in VSMCs from WKY compared to those from Wistar rats ; (3) in cultured cells (explant), the Kν density was very low.
Although the patch-clamp data were compared with those from RT-PCR, we cannot conclude that Kν3.4 plays a major role in the differences observed in patch-clamp experiments between Wistar and WKY rats, because (1) this isoform seemed to be expressed only weakly is VSMCs from mesenteric artery, even in WKY rats, and (2) our RT-PCR analysis was restricted to three isoforms Dans ce travail, nous avons caractérisé le courant potassique dans trios types de préparations : des cellules musculaires lisses vasculaires (CLMVs) isolées enzymatiquement à partir d’artère mésentérique de rats Wistar et Wistar Kyoto (WKY) et des cellules en culture primaire provenant d’explant d’artère mésentérique de rat Wistar. Nous avons tenté de déterminer l’implication de trois isoformes des canaux potassiques voltage)dépendants (Kν) dans ce courant K+ : les Kν1.5, Kν2.1 et Kν3.4.
Dans un premier temps, il fallait s’assurer de la présence de ces Kν dans les tissus à analyser. Deux techniques ont été utilisées : le Western Blot, qui nous indique si ces protéines sont exprimées, et la RT-PCR semi-quantitative, qui nous renseigne sur la présence d’ARNm de ces canaux. C’est essentiellement grâce à la RT-PCR semi-quantitative que nous pouvons conclure que (1) les trois isoformes, mais surtout le Kν2.1, sont exprimées dans les CMLVs isolées enzymatiquement, alors que seul Kν2.1 est détectable dans les cellules cultivées à partir d’explant ; (2) l’expression des Kν au niveau des artères mésentériques de rats Wistar et WKY sont équivalentes en ce qui concerne les Kν1.5 et Kν2.1, alors que l’expression des Kν3.4 est nettement plus importante chez les rats WKY que chez les rats Wistar.
La technique du patch clamp nous a permis de mesurer l’activité électrophysiologique globale des Kν au niveau de cellules obtenues enzymatiquement (Wistar et WKY) et de cellules cultivées à partir d’explant. Des analyses d’intensité de courant potassique (solutions sans Ca2+) en fonction du voltage ainsi que des courbes d’inactivation en fonction du voltage ont été effectuées. Les résultats obtenus indiquent que (1) la densité des canaux potassiques est nettement plus élevée au niveau des CMLVs de rats WKY que dans les CMLVs des rats Wistar ; (2) les Kν s’inactivent à des voltages plus positifs dans les cellules de rats WKY que dans celles de rats Wistar ; (3) avec les cellules d’explant, la densité de courant potassique observée est très faible.
Bien que les résultats obtenus en patch clamp soient compatibles avec ceux fournis par la RT-PCR, nous ne pouvons conclure que le Kν3.4 joue un rôle majeur dans les différences observées en patch clamp entre rats Wistar et WKY, puisque un rôle majeur dans cet isoforme paraît peu exprimé dans l’artère mésentérique, même chez le rat WKY, et que d’autre part notre analyse en RT-PCR s’est limitée à 3 isoformes


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Etude du promoteur de la glomuline et de fragments de celui-ci conférant la spécificité d’expression dans les cellules musculaires lisses vasculaires

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Abstract

Among vascular anomalies, glomuvenous malformations (GVM) are localized cutaneous lesions, often present at birth and expanding slowly with growth. They are caused by mutations inducing loss of function in the GLOMULIN, which alters the differentiation of vascular smooth muscle cells (VSMCs). Resulting glomus cells have an abnormally rounded shape and do not express some specific markers of vSMC. Dominant inheritrance is explained by the discovery of second-hit mutations wich locally induce complete loss of glomulin in the lesions. By in situ hybridization, the glomulin expression is specific for vascular smooth muscle cells, but its function and regulation of its expression are not yet known. The aim of this work was to find the elements that regulate the spatio-temporal expression of glomulin.
Previously, transgenic mice have been created with a construct (C1) containing the LacZ reporter gene under control of a 5Kb fragment from the region potentially promoter upstream of the ATG of glomulin. In the work reported here, we compared the reporter gene expression with the profile in the conventional KO containing a similar knock-in. In both cases, a vascular staining was found but is not only restricted to vSMC. We hypothesized that a part of intron 2, absent from the two constructs plays a role in regulating expression. Indeed, it is conserved between species and contains binding sites for GKLF, transcriptionnal repressor important in vSMC. Two novel constructs were designed, adding intron 2 downstream of LacZ (C2), or keeping the wild-type context and integrating LacZ after exon 3 (C3). Embryos that will derive from these transgenes should provide answers about the role of this intron. Finally, we also started experiments for overexpression or inhibition of GKLF in vSMC to quantify its effect on glomuline expression by real-time PCR. Therefore, a method of derivation and cultivation of vSMC from mouse aortas was established Parmi les anomalies vasculaires, les malformations glomuveineuses (GVM) sont des lésions cutanées localisées, présentes le plus souvent à la naissance et qui s’étendent lentement avec la croissance. Elles sont causées par des pertes de fonction dans le gène GLOMULINE ce qui altère la différenciation des cellules musculaires lisses vasculaires (vSMC). Les cellules glomiques qui en résultent ont une forme anormalement arrondie et n’expriment pas certains marqueurs spécifiques des vSMC. La transmission suit un mode dominant qui s’explique par la découverte de mutations second-hit induisant une perte locale complète de la glomuline dans les lésions. Il a été montré par hybridation in situ que l’expression de la glomuline est spécifique des vSMC. La fonction et la régulation de la glomuline ne sont pas encore bien connues et ce mémoire a pour but de découvrir des éléments qui contrôlent son expression spatio-temporelle.
Précédemment, des souris transgèniques ont été créées avec une construction (C1) contenant le gène rapporteur LacZ sous contrôle d’un fragment d’environ 5Kb de la région potentiellement promotrice située en amont de l’ATG de la glomuline. Ce mémoire compare le profil d’expression du gène rapporteur dans les lignées transgéniques à celui du KO conventionnel qui contient un knock-in similaire. Dans les deux cas, un marquage vasculaire a été révélé mais celui-ci n’est pas strictement limité aux vSMC. L’hypothèse à été posée qu’une partie de l’intron 2 absente de ces deux constructions jouerait un rôle dans la régulation de l’expression. En effet, cette région est conservée entre plusieurs espèces et contient notamment des sites pour GKLF, un répresseur de transcription important des vSMC. Deux nouvelles constructions ont donc été créées pour ajouter l’intron 2 en aval du gène LacZ (C2) ou en conservant le contexte sauvage et en intégrant le LacZ après l’exon 3 (C3). Les embryons qui en dériveront devraient apporter des réponses quant au rôle de cet intron. Finalement, nous avons réalisé les étapes préliminaires pour une surexpression ou inhibition de GKLF dans les vSMC afin de mesurer, par PCR en temps réel, les conséquences sur l’expression de GLOMULINE. Pour ce faire, une méthode de dérivation de vSMC à partir d’aortes de souris a été mise au point


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Etude des propriétés électrophysiologiques et pharmacologiques des canaux potassiques voltage-dépendants dans les cellules musculaires lisses vasculaires
Authors: --- ---
Year: 2007 Publisher: Bruxelles: UCL,

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Abstract

Potassium channels play a prominent role in the regulation of membrane potential. Among these channels, voltage-dependent Kv channels form a large family of proteins in which several subtypes have been identified (Kv1.x to Kv 11.x). These channels are involved in several pathologies and might contribute to the development of arterial hypertension.
The aim of this work is to study the pharmacological and electrophysiological properties of Kv channels expressed in mesenteric artery. We have used whole cell patch clamp technique on freshly isolated smooth muscle cells from the rat superior mesenteric artery.
We have recorded potassium currents activating around -40 mV and showing a slow inactivation (τ≈3s) in response to a prolonged depolarising stimulation (10s). Only the inactivating component of the current is sensitive to 4-aminopyridine, a selective inhibitor of Kv channels (0.1 to 5mM).
In order to investigate the potential modulation of these channels by calcium, we have tested the effect of 0 and 2 mM calcium in the extracellular solution. No alteration in the Kv current was associated with the change in extracellular calcium. Surprisingly, lowering the extracellular calcium concentration markedly decreased the inhibitory effect of the low concentrations of 4-aminopyridine (4-AP, 0.1 to 0.5 mM) on the K current : 0.5 mM 4-AP inhibited the inactivating component of the K current by 8% in the absence of calcium compared to 35% in the presence of 2 mM calcium. The effect of higher concentrations of 4-AP was unaffected. 4-AP inhibition was also tested in the presence of nimodipine, an inhibitor of L-type voltage-gated calcium channels, to determine whether intracellular calcium could affect the inhibitory potency of 4-AP. Our results show that K current inhibition by 4-AP was increased in the presence of nimodipine, suggesting that calcium entry also plays a role in the modulation of Kv channels.
The contribution of the different subtypes of Kv channels to the current was investigated to determine whether the effect of calcium on low 4-AP concentration was related to the nature of the Kv isoform involved in the response. A Western-Bolt study identified the expression of Kv2.1 in mesenteric artery form Wistar rat. This was confirmed by using stromatoxin, a reported specific inhibitor of Kv2.x channels. Stromatoxin inhibited more than 45% of the inactivating component of the K current, but did not affect either the fraction of the current sensitive to low 4-AP, or the calcium modulation of the effect of 4-AP. In the presence of stromatoxin, the typical U shape of the steady state inactivation curve, which is a property of Kv2.1 channel current, disappeared, and the inactivation curve wwas shifted to voltages. Psora-4, a new inhibitor of Kv1.3 and Kv1.5 was tested to study the involvement of these channels in the K current. Preliminary results indicated that psora-4 inhibited the inactivating component by 18% but strongly inhibited the non-inactivating component of the current. Psora-4 only partially inhibited the 0.5 mM 4-AP-sensitive K current.
Taken together, these results suggest that Kv1.5/Kv1.3 but not Kv2.1 contribute to the component of the K current sensitive to low concentration of 4-AP.
Functional role of the 4-AP stromatoxin-sensitive currents was tested by measuring the contractile activity evoked by increasing KCI concentrations from 6 to 15mM in the presence of the calcium channel agonist BayK8644 in isolated mesenteric artery mounted in a myograph. The results showed that in the presence of 4-AP 0.5 and 5 mM, contraction was increased for KCI. These data indicated that the K channels identified in the electrophysiology experiments play a role in the regulation of the membrane potential


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Caractérisation de l’expression de la glomuline

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Abstract

The GLOMULIN gene (GLMN), which codes for a protein of the same name, was identified in the laboratory of Prof Miika Vikkula, where this thesis was undertaken. This gene, when mutated, is responsible for a particular sub-type of vascular anomaly: glomuvenous malformations (GVM). GVMs are cutaneous lesions charaterized by enlarged venous channels, surrounded by abnormally-differentiated vascular smooth muscle cells (vSMCs), called “glomus cells”. GLOMULIN protein is normally expressed by vSMCs, and seems to play a role in their differentiation, through interactions with components of the TGFb and HGF signaling pathways. A variety of double-hits that cause complete localized absence of GLOMULIN, have been identified in the context of GVM lesions. While studies have yielded many insights into the nature of this molecule, the precise function of GLOMULIN remains to be unravelled. The aim of this thesis, therefore, was a detailed assessment of GLOMULIN expression, in order to further our understanding of the protein and its functions.
In the course of this study, we characterized a commercially available antibody to GLOMULIN, which we then used in order to analyze expression of the protein in healthy and GVM-tissue by immunohistochemistry. The antibody being specific for the human protein, we studied Glmn expression during development using in situ hybridization instead, to assess for RNA-expression in paraffin-sections derived from mouse embryos. Thus, the expression of this molecule in wild-type mice at different developmental stages, was compared to that of a variety of other vSMCmarkers, tools which will allow for better characterization of GLOMULIN expression in human tissues, as well as in knock-out and transgenic mice Le gène GLOMULINE (GLMN), codant pour une protéine du même nom, a été identifié au sein du laboratoire hôte de ce mémoire. Ce gène, lorsqu’il est muté, est responsable d’un sous-type d’anomalies vasculaires : les malformations glomuveineuses (GVM). Les GVM sont des lésions cutanées qui se caractérisent par un élargissement des canaux veineux et par la présence, autour de ces vaisseaux, de cellules musculaires lisses mal différenciées, nommées cellules glomiques. La protéine GLOMULINE est normalement exprimée par les cellules musculaires lisses vasculaires. Il semble que cette protéine joue un rôle dans la différenciation de ces cellules en interagissant avec des éléments des voies de signalisation du TGFβ et du HGF. Il a également été identifié, au sein des lésions glomuveineuses, différents doubles hits qui entrainent une absence localisée de la GLOMULINE. Malgré les connaissances que nous possédons sur ce gène et sa protéine, la fonction de la GLMN reste encore méconnue. Le but de ce mémoire était, dès lors, d’acquérir une connaissance plus précise sur l’expression de cette protéine, afin que nous puissions par la suite mieux comprendre sa (ses) fonction(s).
Au cours ce mémoire, nous avons caractérisé un anticorps commercial dirigé contre la GLOMULINE, afin d’analyser par immunohistochimie l’expression de cette protéine dans des tissus sains et pathologiques. Cet anticorps ne reconnaissant que la protéine humaine, nous avons également adapté la technique d’hybridation in situ pour caractériser l’expression de l’ARN de Glmn sur des coupes en paraffine d’embryons de souris. L’expression de la Glmn, chez des souris sauvages à différents stades embryonnaires, a été comparée à celle d’autres marqueurs de cellules musculaires lisses. Ces outils pourront, par la suite, être utilisés pour compléter la caractérisation de l’expression de la GLOMULINE, d’une part dans les tissus humains, et d’autres part chez les souris knock out et transgéniques

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