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MicroRNAs ( mi Rs) arc small single-stranded non-coding endogenous RNAs with a length between 20 and 25 nucleotides. They modulate several major signaling pathways implicated in cell cycle, apoptosis, development etc. They constitute potential tools for diagnosis or therapeutic uses. The first field in which an application was considered is cancer. MiR implicated in this process arc classified in tree families: oncomiRs. metastamiRs and oncosuppressors. Two technics have been developed to inhibit the two first families, they are named antagomiRs and miRs sponges. MiRs mimics have been developed to promote oncosuppressor expression. In addition to their application in the treatment of cancer. these technics arc also interesting to treat viral infections. lt is the case of rniR-122 which is implicated in the stabilization of hepatitis C viral genome. During this disease. rni R-122 is overex pressed. An antagomi R of rni R-122 has been recently developed. the Miravirsen. It has reached the stage II of clinical trial. the first trial was completed in 201 1 . Both in human and animal, the Miravirsen highly decreases the amount of viral genomic RNA without inducing any resistance. We probably still far from using this antagomi R in clinical practice (nowadays, at long term the risk of cancer induced by Miravirsen is still possible). nevertheless. this is proof of concept that modulating rniRs is possible therapeutic strategy. Les microARNs ou miRs sont de petits ARNs simples brins endogènes, non-codants dont la longueur varie de 20 à 25 nucléotides. De par leur action sur de nombreuses voies de signalisations impliquées dans le cycle cellulaire, l'apoptose ou le développement ils représentent un outil potentiel tant diagnostique que thérapeutique. Le premier domaine dans lequel une application a été envisagée est le domaine du cancer, les miRs impliqués sont classés en trois familles: oncomiRs, mestatamiRs et miRs oncosuppresseurs. Afin d'inhiber les deux premiers, deux techniques ont été développées: les antagomiRs et les miRs sponges. Pour combler une réduction de disponibilité en miRs oncosuppresseurs, des miRs mimics ont aussi été développés. Outre leur application dans le traitement du cancer, ces différentes techniques ont rencontré d'autres besoins thérapeutiques, comme la luttre contre des infections virales. C'est le cas du MiR-122 qui est impliqué dans la stabilisation du génome viral responsable de l'hépatite C et qui est surexprimé pendant une infection par ce virus. Un antagomiR de miR-122 a été récemment développé sous le nom de Miravirsen. Miravirsen est passé au stade des études cliniques dont une première phase II s'est terminée en novembre 2011. Chez l'homme comme chez l'animal, le Miravirsen réduit considérablement la charge en ARN viral sans que ne se développe de résistance virale. Si nous sommes encore loin de l'utilisation de cet antagomiR en pratique clinique (à ce jour, le Miravirsen ne peut se démarquer d'un risque de cancérisation à long terme), il constitue néanmoins une preuve de concept intéressante pour le développement d'autres antagomiRs thérapeutiques.

MicroRNAs

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Cardiovascular diseases are among the leading causes of death in the world. Endothelial dysfunction is an early event that contributes to the pathological process and is characterized by a reduction in endothelium-derived nitric oxide (NO) production and by an increased oxidative stress. lt has been recently shown that microRNAs (miRs) are involved in cardiovascular diseases. Ex vivo preliminary studies performed in the FATH laboratory highlighted an enhanced NO-mediated vaso-relaxation when miR-199a-3p or miR-199a-Sp are inhibited. NO is a potent endogenous vasodilator that promotes vasodilation, inhibits platelets aggregation and inhibits leucocytes adhesion. In the endothelial cells, this molecule is generated by endothelial nitric oxide-synthase (eNOS). lts expression and activity, and then its ability to produce NO, are regulated by transcriptional, posttranscriptional and posttranslational modifications. The goal of this work is to study molecular targets of these miRs in endothelial cells using transfection of specific inhibitors (LNA) against miRs199a-3p/a-Sp. This approach will allow us to investigate implication of these miRs in the regulation of the NOS/NO pathway and their role in vascular physiopathology. We first confirmed with in vitro experiments that miR-199a-3p inhibition induces an increase in NO production using electro-paramagnetic resonance (EPR). The increased NO-generation is due to phosphorylation mediated-eNOS activation. The study of eNOS regulation pathways when miR-199a-3p is inhibited revealed the involvement of multiple proteins including the kinase Akt and the phosphatase calcineurine. We also showed that the expression of the eNOS allosteric modulator, caveolin-1,was not modified after miR-199a-3p inhibition. A similar approach has been followed to evaluate miR-199a-Sp targets. ln cultured endothelial cells, inhibition of this miR also promotes an increase in NO production. As the miR-199a-3p, miR-199a-Sp inhibition allows a phosphorylation mediated-eNOS activation targeting Akt and calcineurine.lt is interesting to note that NO's half-life could be modified. lndeed we observed that miR-199a-Sp inhibition seems to be associated with an increase of superoxide dismutase (SODl) expression. The increase of Hifla and VEGF expression in endothelial cells treated with LNA 199a-Sp and the Matrigel angiogenesis assay confirm that this miR takes part to the hypoxic stress response and that miR-199a-Sp directly modulates angiogenesis.ln conclusion, our work allowed us to identify several direct and indirect endothelial targets of miRs199a-3p and a­ Sp, responsible for the NOS/NO pathway modulation suggesting an important role of endothelial functions regulators for these miRs. La dysfonction endothéliale est un événement précoce au développement des pathologies cardiovasculaires, une des causes majeures de décès dans le monde. Elle est caractérisée notamment par une incapacité de l'endothélium à générer des quantités suffisantes de monoxyde d'azote (NO) pour assurer l'homéostasie vasculaire ainsi que par une augmentation du stress oxydatif. D'autre part, il a été récemment établi que les microARNs (miRs) sont impliqués dans les pathologies cardiovasculaires. Des études préliminaires ex vivo réalisées au laboratoire ont mis en évidence qu'inhiber le miR-199a-3p ou le miR-199a-Sp améliore la relaxation vasculaire médiée par le NO. Cette molécule est synthétisée dans les cellules endothéliales par la NO-synthase endothéliale (eNOS). L'expression et l'activité de cette protéine, et ainsi sa capacité à produire du NO, sont régulées par des modifications transcriptionnelles, post­transcriptionnelles et post-traductionnelles. Dans ce contexte, le but de ce mémoire est d'étudier les cibles moléculaires de ces miRs dans les cellules endothéliales par transfection d'inhibiteurs (LNA) dirigés contre les miR-199a-3p/Sp afin de mettre en évidence leur implication dans la régulation de la voie NOS/NO ainsi que leur rôle dans la physiopathologie vasculaire. Nous avons d'abord confirmé in vitro que l'inhibition du miR-199a-3p provoque une augmentation de la production de NO en utilisant la résonance électro-paramagnétique (EPR). Cette production accrue résulte de l'activation d'eNOS par un changement des niveaux de phosphorylation. L'étude des voies de régulation d'eNOS, lorsque miR-199a-3p est inhibé, révèle l'implication de plusieurs protéines dont la kinase Akt et la phosphatase, calcineurine. Le modulateur allostérique d'eNOS, cavéoline-1, n'est lui pas modifié. Une approche similaire a été suivie pour évaluer les cibles du miR-199a-Sp. Dans les cellules endothéliales en culture, l'inhibition de ce miR induit aussi une augmentation de la production de NO. Comme pour le miR-199a-3p, l'inhibition du miR-199a-Sp permet une activation d'eNOS par phosphorylation via un ciblage d'Akt et de la calcineurine. Il est intéressant de noter qu'au-delà de la production du NO, sa demi-vie peut aussi être modifiée. Nous avons en effet observé que l'inhibition du R-l99a-Sp est associée à une augmentation de l'expression du superoxyde dismutase (SOD1), l’augmentation de l'expression de Hifα et du VEGF dans les cellules endothéliales traitées par le LNA. 199a-5p ainsi que la culture de ces cellules en Matrigel confirme que ce Mir participe à la réponse aux stress hypoxiques et suggère qu’il module l’angiogenèse directement. En conclusion, ce mémoire a permis d’identifier plusieurs cibles endothéliales directes et indirectes des miR-199a-3p/5p, responsables de la modulation de la voie NOS/no suggérant un rôle important de régulateurs des fonctions endothéliales par ces microARNS.

MicroRNAs --- Endothelial Cells

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MicroRNAs (miRNAs) have recently emerged as key post-transcriptional regulators of cellular processes such as oncogenesis and the modulation of the immune response, through gene silencing. miRNAs in biological fluids, known as extracellular or circulating miRNAs, are much more resistant to degradation than other types of RNAs. Certain miRNA expression profiles could potentially constitute specific disease signatures.MS is a chronic inflammatory demyelinating disease of the central nervous system (eNS) which results from an immune dysregulation caused by complicated interactions between genetic and environmental factors, although its exact etiology remains unknown. Neurodegeneration and failure of eNS repair lead to multifocal scars or "plaques" in brain and spinal cord. There are different forms of MS, of which the most common is the "relapsing-remitting" form, characterized by clearly defined attacks (called relapses) of worsening neurology function followed by partial or complete recovery. They are separated by periods of remission, during which there is no apparent progression of the disease. This study aims at evaluating the potential of miRNAs as biomarkers of MS disease activity, especially in mechanisms underlying relapse or remitting states. Firstly, a global miRNA screening by PeR array on pooled miRNA samples from MS patients, healthy controls (Hes) or symptomatic controls (Ses), coming from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), serum and cerebrospinal fluid (CSF), was performed in collaboration with Qiagen. Several miRNAs in the eSF show a differential expression between MS patients and ses, whereas few of them seem to be regulated in PBMes or serum. We performed individual qPeR analysis of preselected miRNAs on the same samples and obtained promising preliminary results on the expression of eSF miRNAs. We decided then to increase the number of eSF samples analyzed. Ten miRNAs show differential expression levels between relapsing or remitting MS patients and SCs, among which: miR-150, miR-146a, miR-155 and miR-326. These results open up research perspectives into the target genes of these miRNAs and their functional relevance in MS pathogenesis. Les microARN (miARN) sont connus pour être des régulateurs-clés post-transcriptionnels dans de nombreux processus cellulaires tels que l'oncogenèse et la modulation de la réponse immunitaire. Certains miARN, dits « extracellulaires », se trouvent dans les fluides biologiques sous forme extrêmement stables comparés aux autres types d'ARN, avec des profils d'expression qui peuvent être spécifiques à une pathologie. La sclérose en plaques (SEP) est une maladie inflammatoire chronique qui affecte le système nerveux central (SNC) et dont la physiopathologie résulte d'un dérèglement immunitaire. Son étiologie est encore inconnue : la SEP résulterait d'interactions complexes entre facteurs génétiques et environnementaux qui mèneraient à une réponse immunitaire inappropriée, responsable d'une destruction de la gaine de myéline et de dégénérescence axonale. Cette destruction entraîne des lésions ou « plaques » multifocales au niveau du cerveau et de la moelle épinière. Il existe plusieurs formes de la SEP dont la plus répandue, dite « rémittente-récurrente » (RR), est caractérisée par l'apparition de déficits neurologiques subaigus appelés « poussée » suivie d'une période de rémission durant laquelle la maladie ne progresse pas.Le but de ce projet est d'évaluer le potentiel des miARN en tant que biomarqueurs du risque évolutif de la SEP, en particulier dans les mécanismes qui sous-tendent les états de poussée ou de rémission. Pour ce faire, un screening global de miARN par PCR array a été effectué en collaboration avec la firme Qiagen sur des échantillons poolés provenant de patients SEP ou de sujets contrôles, issus de 3 compartiments différents : les cellules mononuclées sanguines (PBMCs), le sérum et le liquide céphalorachidien (LCR). Les résultats de cette analyse ont montré que l'expression de la plupart des miARN varie dans le LCR entre patients SEP et contrôles. En comparaison, peu de miARN semblent régulés dans les PBMCs ou le sérum. En parallèle, sur ces mêmes échantillons, l'expression individuelle de miARN présélectionnés a été quantifiée par qPCR, avec des résultats préliminaires encourageants, notamment dans le LCR. Nous avons dès lors décidé d'analyser de manière plus approfondie les miARN issus du LCR, en élargissant l'analyse à un plus grand nombre d’échantillons. Dix miARN présentent une différence significative de niveau d'expression dans le LCR entre patients SEP en poussée, patient s en rémission ou sujets contrôles, dont en particulier : miR-150, miR-146a, miR-155 et miR-326. Ces résultats ouvrent des perspectives quant à l'analyse des gènes cibles de ces miARN ainsi que de leur relevance fonctionnelle dans la physiopathologie de la SEP.

Multiple Sclerosis --- Biomarkers --- MicroRNAs

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MicroRNAs (miRNAs) are classes of small RNAs that modulate gene expression. Through recognition of sequence complementary target elements found in the 3’UTR of cellular mRNAs, miRNAs induce mRNA translation inhibition or catalytic mRNA degradation. In plants and insects, miRNAs can also play a role in antiviral immunity through recognition of viral mRNA or viral genomic RNA. Nevertheless, many plant and insect viruses inhibit miRNAs activity by expressing anti-silencer proteins. For example, TBSV, a Tombusvirus infecting tomato plants, expresses a protein called p19 that binds miRNAs and thus prevents target recognition. The insect virus flock house virus (FHV) expresses a protein called b2 that binds miRNAs and their precursors.
The aim of this present work was to study the effect of cellular miRNAs on Theiler’s virus replication, and to analyse whether the virus can interfere with cellular miRNAs activity.
We designed a vector allowing to test viral or cellular anti-silencer protein activity. For this purpose, we constructed a lentiviral vector carrying one of four let-7a miRNA target sequences in the 3’ non-coding region of the Renilla luciferase gene. This tool seems functional although it has to be validated definitively. Using these constructs, we failed to observe anti-silencer activity of TBSV p19 protein, in contrast to other studies that reported the activity of this protein in mammalian cells. Similarly, the flock house virus b2 protein showed only low activity which seems to be partly independent on its effect on the microRNA tested.
Next, we evaluated the impact on viral replication, of the presence of a microRNA target sequence introduced in the coding region of Theiler’s virus genome. We detected a moderate effect of microRNA on viral replication. Consistent with this observation, a theoretical analysis of the virus sequence suggests a low selection pressure toward the elimination of miRNAs target sequences in the main ORF of the viral genome. This is in contrast with other studies that observed a significant effect of microRNAs on the non-coding regions of other Picornaviruses Les microRNA (miRNA) cellulaires sont des petites molécules d’ARN dont la fonction est de réguler l’expression des gènes cellulaires. En s’hybridant par complémentarité de séquence à l’extrémité 3’UTR des ARN messager, ils peuvent induire, soit l’inhibition de la traduction de ces ARNm, soit leur dégradation. Chez les plantes et insectes, les miRNA peuvent également être impliqués dans l’immunité antivirale en s’hybridant à l’ARNm ou à l’ARN génomique d’un virus. Cependant, la plupart des virus cibles de ces miRNA cellulaires inhibent l’activité des miRNA en codant des protéines « suppresseur » des miRNA. Par exemple, le Tombusvirus TBSV, infectant les plantes de tomates, exprime une protéine appelée p19 qui lie les miRNA et les empêche de s’hybrider à leur séquence cible. De même, le Flock house virus (FHV) infectant les insectes encode une protéine appelée B2 qui séquestre les miRNA et leurs précurseurs.
L’objectif de ce mémoire était d’une part, d’étudier l’effet des miRNA endogènes sur la réplication du virus de Theiler, et d’autre part, d’analyser dans quelle mesure le virus peut interférer avec l’activité des miRNA cellulaires.
Nous avons construit un vecteur permettant de tester l’activité de protéines (virales ou cellulaires) antagonistes de la voie miRNA (activté « anti-silencer »). Pour cela, la séquence codant la luciférase de Renilla a été insérée dans un vecteur lentiviral avec, dans sa région 3‘ non-codante, la séquence cible du miRNA endogène let-7a. Cet outil semble fonctionnel bien qu’il doive encore être validé de manière définitive. A l’aide de ce vecteur, nous n’avons observé aucune activité anti-silencer de la protéine p19 du TBSV, alors que l’activité de cette protéine avait été montrée dans les cellules de mammifères. La protéine b2 du flock house virus n’a aussi montré qu’une relativement faible activité, partiellement indépendante de son effet sur le microRNA testé.
Par ailleurs, nous avons évalué l’incidence de la présence de la séquence cible d’un microRNA dans la région codante du génome du virus de Theiler. Nous avons détecté un effet modéré du microRNA sur la réplication virale. En accord avec cette observation, une analyse théorique de la séquence du virus suggère une faible pression de sélection en vue de l’élimination des séquences cibles des miRNA dans l’ORF principale du génome viral. Ceci contraste avec les effets importants, observés par d’autres études, des microRNA sur les régions non-codantes d’autres picornavirus

MicroRNAs --- Theilovirus --- Virus Replication --- Viral Proteins --- Picornaviridae

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ln this work , we aimed to develop novel tools for the analysis of function and biogenesis of micrq-RNAs . Since we worked on two different methods, this work is divided in two parts.The aim of the first part was to develop a quick, reliable and cheap method to synthesize and purify precursor-microRNAs (premiR). Our method is based on in vitro transcription by T7 RNA polymerase. To overcome limitations of this technique, we added special RNA structures (ribozymes) capable of cleaving the transcript in an autocatalytic manner and leaving only the desired premiR sequence. To be able to extract the ribozymes, which could interfere with further processing of the premiR, we added a second RNA structure (aptamer) capable of binding to an affinity matrix. Eventually, we were able to synthesize and purify different premiRs that could be cleaved by the enzyme Dicer.The second part of this thesis focused on the inhibition of micro-RNA. There already are different methods to inhibit them but they all suffer serious limitations. That's why we attempted to improve the method of the so-called micro-RNA sponges. These are transcr ipt containing many binding sites for a miR. These transcripts act as compet itive inhibitors by trapping the micro-RNA. However, these sponges are far from efficient due to the destabilization caused by the binding of the micro-RNA. This destabilization is caused by the decapping and deadenylation of the transcript. We therefore proposed that, if we were able to produce circular sponges these would probably be more stable and hopefully more efficient. To explore this hypothesis, we first tried to find a model allowing us to generate circular miRNA sponges. Three different experimental were generated and assessed for their capacity to generate circular sponge transcripts. Furthermore, we tested whether the best of the experimental systems could be integrated into a lentiviral vector that would allow us to infect a variety of cells.Future work will have to demonstrate whether the generated circular sponges are more efficient inhibitors of miRNA function when compared to their linear counterparts . Au cours de ce mémoire, nous nous sommes intéressés au développement de nouveaux outils permettant l'analyse de la fonction et de la biogenèse des micro-ARNs . Dans cette optique, nous avons exploré deux méthodes différentes. Par conséquent , ce travail est scindé en deux parties.Le but de la première partie de ce mémoire était le développement d'une méthode de synthèse de micro-RNA précurseur (premiR). A insi, nous avons mis au point une méthode sur base de la transcription in vitro. Afin d'éviter certaines contraintes du point de vue de la séquence , nous avons flanqué le premiR d'une séquence ARN particulière (ribozyme) capable de cliver tout nucléotides supplémenta ire éventuels. Ensuite, afin d'être capable d'extraire ces séquences contaminantes, nous avons complémenté les ribozymes d'une seconde structure ARN (aptamères) capable de se lier avec une matrice d'affinité. Suite à la transcription in vitro et la purification du premiR, nous avons analysé le résultat par électrophorèse en gel de polyacrylamide dénaturant et « Northern Blot ». Nous avons pu démontrer l'efficacité de notre méthode à produire des premiR, les purifier ainsi que montrer l'utilité de ceux-ci comme outils pour étudier le clivage catalysé par Dicer.La seconde partie de ce mémoire se penche sur le développement d'une nouvelle méthode d'inhibition des miRs. En effet, malgré l'existence d'outils permettant leur inhibition, ceux-ci souffrent encore de nombreux désavantages . Nous avons donc tenté d'améliorer la méthode d'éponges à miR décr ite précédemment dans la littérature. Cependant, afin d'améliorer leur stabilité, nous avec tenté de produire des éponges circulaires. Pour cela nous avons complémenté notre construction de signaux d'épissage et de séquences répétitives nécessaires à la circularisation comme décrit dans la littérature. Après transfection de nos constructions plasmidiques, nous avons mesuré les niveaux d'ARN circulaires et linéaires à l'aide de PCR quantitative . Ensuite nous avons développé des vecteurs lentiviraux permettant l'intégration stable de ces constructions. De futures études devront démonter si le système ainsi développé présente des améliorations par rapport aux autres techniques.

MicroRNAs --- RNA Splicing --- RNA --- Transcription, Genetic