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MAGEA I gene, the expression of which is normally restricted to the germinal lineage, is activated in a variety of tumors of somatic origin. This aberrant activation was associated with demethylation 0f the 5’ region of ihe gene, but the causes of this epigenetic deregulation remain poorly understood. Recent studies show that MAGEAI gene demethylation in tumoral cells is associated with gains of histone H3 acetylation (H3Ac) and of histone H3 lysine 4 dimethylation (H3K4me2) at the level of ifs 5 region. The purpose of this study was to determine if these active histone modifications could be at the origin of DNA demethylation within the MAGEA I gene. To this end, we used the cellular clone MZ2-MEL.TrHM, which contains a methylated transgene (MAGEAI/hph). This hybrid transgene contains the coding sequence hph, which confers resistance to hygromycin, under control 0f the MAGEA 1 promoter. The methylated transgene however is not expressed, and celis are sensitive to hygromycin. Nevertheless, when M12—MEL.TrHM ceils are exposed to a DNA demethylating agent, hygromycin-resistant clones appear. To study the influence of histone acetylation, MZ2-MEL.TrHM cells were incubated with trichostatin A (TSA), a deacetylase inhibitor. Our results show that the resulting hyperacetylation Ied to transient derepression of the MAGEAI/hph transgene, but did not induce the appearance of hygromycin-resistant clones, in which the transgene was demethylated and durably activated. Moreover, our chromatin immunoprecipitation analyses indicate that the repressive state of the MAGEA I /hph transgene is associated with the local presence 0f LSD 1, a specific H3K4 demethylase. We therefore tested if the inhibition of LSD1, and consequently the gain of H3K4me2 methylation, could provoke DNA demethylation and stable activation of the MAGEAIIhph transgene. However, we neither observed transgene activation, nor obtained hygromycin-resistant clones, as a result 0f LSD1 inhibition in MZ2-MEL.TrHM cells. Finally, we observed a gain of H3Ac and H3K4me2 marks within the MAGEA1Ihph transgene, following transient inhibition of the DNA methyliransferase DNMT1. This suggests that these active histone modifications are o consequence, rather than a cause, of DNA demethylation Le gène MAGEAI, dont l’expression est normalement restreinte à la lignée germinale, est activé dans une variété de tumeurs d’origine somatique. Cette activation aberrante a été associée à la déméthylation de la région promotrice du gène, mais les causes de cette dérégulation épigénétique demeurent incomprises. Des études récentes montrent que la déméthylation du gène MAGEAI dans les cellules tumorales s’accompagne d’un gain d’acétylation des histones H3 (H3Ac) et de diméthylation de la lysine 4 des histones H3 (H3K4me2) au niveau de sa région 5’. Le but de ce mémoire était de déterminer si ces modifications d’histones activatrices pouvaient être à l’origine de la déméthylation de l’ADN au sein du gène MAGEA 1. A cette fin, nous avons utilisé le clone cellulaire MZ2-MEL.TrHM, qui contient un transgène hybride MAGEA1/hph méthylé. Celui-ci comporte la séquence codante hph, qui confère la résistance à l’hygromycine, sous contrôle du promoteur de MAGEA 1. Le transgène méthylé n’est cependant pas exprimé, et les cellules sont sensibles à l’hygromycine. Néanmoins, lorsque les cellules MZ2-MEL.TrHM sont exposées à un agent qui induit la déméthylation de l’ADN, des clones résistants à l’hygromycine apparaissent. Pour étudier l’influence de l’acétylation des histones, les cellules MZ2-MEL.TrHM ont été incubées en présence de trichostatin A (TSA), un inhibiteur de désacétylases d’histones. Nos résultats montrent que l’hyperacétylation qui s’ensuit induit une dé-repression transitoire du transgène MAGEAIIhph, mais n’aboutit pas à l’apparition de clones résistants à l’hygromycine dans lesquels le transgène est déméthylé et stablement activé. Par ailleurs, nos analyses d’immunoprécipitation de la chromatine indiquent que l’état réprimé du transgène MAGEA1/hph est associé à la présence locale de LSD1, une déméthylase spécifique de H3K4. Nous avons donc testé si l’inhibition de LSD1, et par conséquent le gain de méthylation H3K4me2, pouvait provoquer la déméthylation (ADN) et l’activation stable du transgène, MAGEAI/hph. Nous n’avons cependant pas observé d’activation du transgène, ni obtenu de clones résistants à l’hygromycine, suite à l’inhibition de LSD1 dans les cellules MZ2-MEL.TrHM. Enfin, nous avons observé un gain des marques H3Ac et H3K4me2 au sein du transgène MAGEAI/hph, suite à l’inhibition transitoire de la méthyltransférase d’ADN DNMT1. Ceci suggère donc que ces modifications d’histones activatrices sont une conséquence, plutôt qu’une cause, de la déméthylation de l’ADN.

MAGEA1 protein, human --- Histones --- DNA Methylation --- Neoplasms

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MAGE-A1 gene belongs to the group of cancer-germline genes which are normally expressed specifically in the male germ cells, and are aberrantly activated in tumors of various histological types. The activation of these genes in tumors reveals antigens recognized by cytolytic T lymphocytes, which are important in cancer immunotherapy.
Previous work showed that the repression of MAGE-A1 gene in normal somatic tissues is due to the methylation of its promoter and that its activation tumors results from a process of DNA demethylation. At the present, the mechanisms responsible for the demethylation of MAGE-A1 gene in the tumors remain to be elucidated.
A recent study undertaken by the team of Victor Lobanenkov (NIH, Bethesda, USA) suggests that BORIS, a transcription factor, specifically expressed in the testis, would be directly responsible for the activation for MAGE-A1 gene and other cancer-germline genes in tumors. Their work indeed shows that, (i) BORIS is activated in a large majority of tumor samples, (ii) the induction of MAGE-A1 gene following treatment by the demethylating agent requires preliminary activation of BORIS, (iii) the overexpression of BORIS by transient transfection induces MAGE-A1 gene activation in normal fibroblasts.
Our objective was to check these assertions. Contrary to the results described by the Lobanekov group, we observed the activation of BORIS gene in a minority of tumor cell lines and tumor tissues. Moreover, a larger number of tumor samples express MAGE-A1 without BORIS. We also noted the absence of BORIS gene expression in clones where MAGE-A1 was activated following a demethylating treatment. Finally, in our experiments of transient transfection, the overexpression of BORIS did not induce activation of MAGE-A1 gene. We thus conclude that BORIS is not expressed in the majority of tumors and that it is not an essential factor for the activation of MAGE-A1 gene Le gène MAGE-A1 appartient au groupe des gènes “cancer-lignée germinale” qui sont normalement exprimés spécifiquement dans les cellules germinales mâles et sont activés de manière aberrante dans des tumeurs de types histologiques variés. L’activation de ces gènes dans les tumeurs fait apparaître des antigènes reconnus par les lymphocytes T cytolytiques. Ces antigènes sont donc utilisés en immunothérapie cancéreuse.
Certains travaux ont montré que la répression du gène MAGE-A1 dans les tissus somatiques normaux est due à la méthylation des son promoteur, et que son activation dans certaines tumeurs résulte d’un processus de déméthylation. A l’heure actuelle, les mécanismes responsables de la déméthylation du gène MAGE-A1 dans les tumeurs restent à élucider.
Une étude récente menée par l’équipe de Victor Lobanenkov (NIH, Bethesda, USA) suggère que BORIS, un facteur de transcription exprimé spécifiquement dans le testicule, serait directement responsable de l’activation du gène MAGE-A1 et d’autres gènes cancer-lignée germinale dans les tumeurs. Leurs travaux montrent en effet que (i) BORISest activé dans une très grande majorité des échantillons tumoraux, (ii) l’induction du gène MAGE-A1 suite au traitement par un agent déméthylant nécessite l’activation préalable du facteur BORIS, (iii) la surexpression du facteur BORIS par transfection transitoire induit l’activation du gène MAGE-A1 dans des fibroblastes normaux.
L’objectif de notre mémoire était de vérifier ces affirmations. Contrairement aux résultats décrits par le groupe de Lobanenkov, nous n’avons observé l’activation du gène BORIS que dans une minorité de lignées tumorales et tissus normaux. Par ailleurs, de nombreux échantillons tumoraux expriment MAGE-A1 sans exprimer BORIS. Nous avons également constaté l’absence de l’expression du gène BORIS dans des clones où MAGE-A1 a été activé suite à un traitement déméthylant. Finalement, dans nos expériences de transfection transitoire, la surexpression de BORIS n’a pas abouti à l’activation de MAGE-A1. Nous concluons donc que BORIS n’est pas exprimé dans la majorité de tumeurs et qu’il n’est pas un facteur obligé pour l’activation du gène MAGE-A1

MAGEA1 protein, human --- CTCFL protein, human --- Immunotherapy --- Antigens --- Transcription Factors --- T Lymphotytes, Cytotoxic --- Immunologic Tests

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Gene MAGE-A1 belongs to a particular group of genes termed cancer-germline genes. In healthy adult individuals, these genes are expressed in male germline cells, whereas they remain silent in somatic tissues. However, their expression becomes aberrantly activated in tumors of different histological origins. Due to this particular expression profile, cancer-germline genes encode tumor-specific antigens, which represent potential targets for therapeutic vaccination against cancer. It has been shown that the silencing of MAGE-A1 in normal somatic tissues is due to CpG methylation within the promoter region of the gene. Aberrant activation of this gene in tumors appears to be associated with a process of DNA demethylation, which frequently affects the genome of cancer cells. The mechanisms underlying this epigenetic alteration in tumor cells are still unknown. Previous transfection experiments with in vitro methylated MAGE-A1 sequences demonstrated that melanoma cells MZ2-MEL, in which the gene is hypomethylated and active, have lost the ability to induce demethylation of newly integrated MAGE-A1 transgene. This suggested that the activation of MAGE-A1 in MZ2-MEL cells results from a historical event of transient demethylation. By performing similar transfection experiments, we now demonstrate that, like MZ2-MEL cells, other MAGE-A1-expressing tumor cells also lack a permanent demethylation activity targeted to the gene. The involvement of a transient DNA demethylation process appears therefore to be a general rule for the activation of MAGE-A1 in tumor cells. Contrary to tumor cells, which originate from somatic precursor cells, embryonic stem cells appear to possess an ongoing DNA demethylation activity. Consistently, previous transfection experiments indicated that mouse embryonic stem cells (mES) are able to induce demethylation of MAGE-A1 transgenes. Here, we show that the demethylation activity in mES cells is targeted to a limited region of the transgene, which is centered on the transcription start site. Moreover, by assessing transgenes carrying mutations within essential promoter elements, we found that the level of transcriptional activity determines the level of hypomethylation of the transgene following transfection in mES cells. Le gène MAGE-A1 appartient au groupe des gènes cancer-lignée germinale. Chez l’adulte, ces gènes sont exprimés dans les cellules germinales mâles, alors qu'ils restent silencieux dans les tissus somatiques. Par contre, suite à une activation aberrante, ces gènes sont exprimés dans des tumeurs d'origines histologiques différentes. Grâce à ce profil d'expression particulier, les gènes cancer-lignée germinale codent des antigènes spécifiques des tumeurs, qui représentent des cibles potentielles pour une vaccination antitumorale. Il a été montré que la répression du gène MAGE-A1 dans les tissus somatiques est due à la méthylation des CpG situés dans la région promotrice du gène. L'activation aberrante de ce gène dans les tumeurs semble être associée à un processus de déméthylation de l'ADN, qui affecte fréquemment le génome des cellules tumorales. Les mécanismes responsables de ces altérations épigénétiques dans les cellules tumorales restent incompris. Des expériences précédentes de transfection de séquences de MAGE-A1 méthylées in vitro ont montré que les cellules de mélanome MZ2-MEL, dans lesquelles le gène MAGE-A1 est hypométhylé et actif, ont perdu la capacité de déméthyler un transgène MAGE-A1 nouvellement intégré. Ceci suggère que l'activation de MAGE-A1 dans les cellules MZ2-MEL résulte d'un évènement historique de déméthylation transitoire. En effectuant des expériences de transfection similaires, nous avons à présent montré que, comme les cellules MZ2-MEL, d'autres cellules tumorales exprimant MAGE-A1 n'ont pas d'activité permanente de déméthylation ciblée sur le gène. L'implication d'un processus de déméthylation transitoire de l'ADN semble donc être une règle générale pour l'activation de MAGE-A1 dans les cellules tumorales. Contrairement aux cellules tumorales qui dérivent de cellules somatiques, les cellules souches embryonnaires semblent posséder une activité permanente de déméthylation de l'ADN. En effet, des expériences antérieures de transfection ont indiqué que les cellules souches embryonnaires de souris (mES) sont capables d'induire la déméthylation d'un transgène MAGE-A1. A présent nous avons montré que l'activité de déméthylation dans les cellules mES est ciblée sur une région limitée du transgène, centrée sur le site d'initiation de la transcription. De plus, en utilisant des transgènes portant des mutations dans des sites essentiels au promoteur, nous avons trouvé que le niveau d'activité transcriptionnelle détermine le niveau d'hypométhylation qu'atteint le transgène après transfection dans les cellules mES.

MAGEA1 protein, human --- Embryonic Stem Cells --- Methylation --- melanoma-specific antigens --- Mice --- Neoplasms