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Primary lymphedema, characterized by a chronic edema, results from defective lymphatic drainage due to abnormal lymphatic vessel development or dysfunction. Among patients affected with lymphedema, associated or not with a syndrome, mutations in at least twenty genes have been identified. Around 40% of the 475 index cases collected by the laboratory can currently be explained by mutations in these genes. Thus, about 60% remain unexplained. In the first part of my work, I focused on the sequencing of a new primary lymphedema gene discovered by the host laboratory by whole exome sequencing to confirm its implication in the pathology. Four mutations were identified by Sanger sequencing in a cohort of 184 patients, including 40 familial cases and 144 sporadic or unclassified ones. This gene comprises 9 exons and code for a protein expressed by endothelial cells. It’s a ligand of a well known endothelial-specific tyrosine kinase receptor. In the second part of this work, we used the small high-throughput sequencing machine Ion Torrent to sequence 66 candidate genes, using a custom AmpliSeq panel designed by our laboratory. This panel contains the 20 genes known to be involved lymphedema, three new genes recently discovery by the laboratory and about 40 candidate genes that encore proteins with direct or indirect implication in the development of the lymphatic system, because of their interaction with protein encoded by the 20 known genes. This new approach reduces drastically the time needed to discover new lymphedema causing genes and will improve the diagnostics of this pathology. At term, the identification of novel genes will allow better understanding of the origin of lymphedema and open the way for development of new treatments. Le lymphœdème primaire est caractérisé par un œdème chronique causé par un drainage lymphatique défectueux dû à un mauvais développement des vaisseaux lymphatiques ou d’une altération fonctionnelle de ceux-ci. Parmi les patients souffrant de lymphœdème primaire héréditaire ou sporadique associé ou non à un syndrome, des mutations dans une vingtaine de gènes ont été identifiées. Environ 40% des 475 cas de lymphœdèmes primaires du laboratoire d’accueil sont actuellement expliqués par une mutation dans un de ces gènes, ce qui laisse encore environ 60% des cas à élucider. Dans la première partir de mon mémoire, je me suis focalisée sur le criblage d’un nouveau gène identifié par séquençage d’exome afin de confirmer son implication dans le développement du lymphœdème primaire. Au total, 4 mutations ont été identifiées par séquençage de Sanger dans une cohorte de 184 patients, à savoir 40 cas familiaux et 144 cas sporadiques. Ce gène se compose de 9 exons et code pour une protéine exprimée dans les cellules endothéliales, agissant comme ligand d’une récepteur tyrosine kinase. Dans la seconde partie de mon mémoire, nous avons utilisé le mini séquenceur haut débit Ion Torrent pour cribler 66 gènes candidats intégrés dans un panel Ampliseq que nous avons fait synthétiser. Ce panel comprend les « gènes de lymphœdème », trois nouveaux gènes découverts récemment par le laboratoire et une quarantaine de gènes candidats codant pour des protéines ayant une implication directe ou indirecte dans le développement du système lymphatique, notamment par interaction avec des protéines encodées par les 20 gènes connus. Plusieurs mutations potentielles ont été observées et pour les patients dont nous disposons de l’ADN d’autres membres de la famille, un séquençage sera effectué afin de vérifier si le changement coségrège avec la pathologie. Cette nouvelle stratégie conduit à un gain de temps considérable dans l’identification de nouveaux gènes causal et permettra à l’avenir de faciliter le diagnostic. A terme, cela permettra de mieux comprendre l’origine des lymphœdèmes et ouvrira la voie au développement de nouveaux traitements

Lymphedema

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Lymphatics --- Lymphedema --- Lymphedema --- Surgery

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This comprehensive book on edema, edited by H.P.M. Verdonk, N. Devoogdt, and R.J. Damstra, serves as an authoritative resource on the diagnosis and treatment of lymphedema. It delves into the anatomy and physiology of the lymphatic system, offering insights into the causes and clinical forms of chronic edema. The third edition incorporates recent advancements in genetic research and a holistic approach to managing chronic diseases. It is designed for healthcare professionals and students seeking an in-depth understanding of lymphovascular care, including diagnosis, clinical approaches, and therapy. Contributions from experts in various disciplines make this a valuable reference for medical practitioners and researchers dedicated to improving patient outcomes in edema management.

Lymphedema. --- Edema.

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Lymphedema, resulting from an accumulation of lymph in tissues, are characterized by chronic edema of the limbs due to defects of the lymphatic system. To date, mutations causing primary lymphedema have been found in eight genes: FLT4 (encoding VEGFR3), FOXC2, SOX18, CCBE1, GJC2, Gata2, PTPN14 and KIF11. We recently proposed a link between the encoded proteins, and around a central pathway, VEGFR3 signaling. However, more than 60% of familial cases and approximately 85 % of sporadic cases among 400 index cases in laboratory remain unexplained by mutations in these genes. We aim to identify new genes involved in primary lymphedema.In the first part of this Master thesis, GJC2, SOX18 and FOXC2 were screened by classical Sanger sequencing for some patients. Two heterozygous missense mutations, one of which is novel, were identified in GJC2. In the second part, we analyzed whole exomes of 42 patients sequenced by Next Generation Sequencing (NGS). Before seeking new mutated genes, the eight genes must be clearly excluded. It has been shown that exome capture covers effectively approximately 80% of exonic regions. Among the genes responsible for lymphedema, some are hardly covered. We identified missing regions in the eight genes, as well as in two genes being validated. We developed a series of multiplex PCRs to fill in the holes and applied this approach to 145 patients on the mini high-throughput sequencer, Personal Genome Machine (PGM, Ion Torrent). Despite several difficulties in establishing this technique, we obtained a good coverage for the missing regions by this method which is faster and with lower cost than classical Sanger sequencing exon by exon. In addition, by adding a few fragments to the multiplex PCRs, we were able to sequence fully five of the genes responsible of lymphedema in order to pre-screen them rapidly before sequencing their exomes. We demonstrate however the limits of this technology for sequencing of complexes genes such as GJC2, SOX18 and FOXC2. By identification, of 9 significant changes, probably mutations, our results confirm the efficacy of targeted high-throughput sequencing to screen known genes, and suggest to replace the large-scale screenings that were usually performed fragment by fragment by Sanger sequencing. Les lymphœdèmes, résultants d'une accumulation de lymphe dans les tissus, se caractérisent par un œdème chronique des membres suite à des défauts du système lymphatique. A ce jour, des mutations à l'origine de lymphœdèmes primaires ont été découvertes dans huit gènes : FLT4 (codant pour le VEGFR3), FOXC2, SOX18, CCBE1, GJC2, GATA2, PTPN14 et KIF11. Nous avons récemment proposé un lien entre les différentes protéines qu'ils codent, et autour d'une voie centrale, la signalisation du VEGFR3. Cependant, plus de 60% des cas familiaux et près de 85% des cas sporadiques parmi les 400 cas index du laboratoire restent inexpliqués. Nous visons à identifier de nouveaux gènes impliqués dans les lymphœdèmes primaires.Dans la première partie de ce mémoire, GJC2, SOX18 et FOXC2 ont été criblés par séquençage classique pour une partie des patients. Deux mutations faux sens hétérozygotes, dont une nouvelle, ont été identifiées dans GJC2. Avant de rechercher de nouveaux gènes mutés, les huit gènes connus doivent pouvoir être clairement exclus. Ainsi, parmi les gènes responsables de lymphœdème, certains ne sont quasiment pas couverts. Dans la deuxième partie, nous avons analysé des exomes de 42 patients séquencés par Next Generation Sequencing (NGS). Il a été montré que la capture d'exome ne couvre efficacement qu'approximativement 80% des régions exoniques. Ainsi parmi les gènes de lymphœdème, certains ne sont quasiment pas couverts. Nous avons répertorié les régions manquantes dans les huit gènes, ainsi que dans deux nouveaux gènes en cours de validation. Nous avons mis au point une série de PCR multiplexes pour combler ces trous et avons appliqué cette approche, pour 145 patients sur le mini séquenceur à haut débit, Persona/ Genome Machine (Ion Torrent). Malgré plusieurs difficultés rencontrées en établissant cette technique, nous avons obtenu une bonne couverture des régions manquantes par cette méthode plus rapide et à moindre coût que le séquençage de Sanger exon par exon. De plus, en ajoutant quelques fragments aux PCR multiplexes, nous parvenons à séquencer entièrement cinq des gènes responsables de lymphœdème dans le but de les pré-cribler rapidement avant de séquencer l'exome de patients. Nous démontrons cependant les limites de cette technologie pour le séquençage de gènes complexes tels que GJC2 , SOX18 et FOXC2. Par l'identification de 9 changements significatifs, probablement des mutations, nos résultats confirment l'efficacité de séquençage à haut débit ciblé pour le criblage des gènes connus, et suggèrent ainsi de remplacer les criblages à large échelle qui étaient habituellement réalisés fragment par fragment par Séquençage de Sanger.

Lymphedema --- High-Throughput Nucleotide Sequencing

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Lymphedema --- Treatment --- Equipment and supplies.