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B-cell chronic lymphocytic leukemia (B-CLL) is the most common form of adult leukemia on the Western world. B-CLL is characterized by the accumulation of mature B lymphocytes, which is explained mainly by a decreased cell mortality due to defect(s) in apoptotic cell death. Therapeutics approaches include corticosteroids, alkylating agents, nucleoside analogues or monoclonal antibodies, alone or in combination. Although these treatments are active, B-CLL remains an incurable disease, because of emergence of resistance. The laboratory where I performed my suited is particularly interested in the mechanisms of action of nucleoside analogues, aiming at improving their clinical efficacy.
My work has been initiated by the observation of a member of the team, L. Bastin-Coyette. He demonstrated that the lymphotoxicity of 2-chloroadenosine (an agonist of adenosine, not used in therapy) was due, at least partly, to a decrease in intracellular ATP. As the nucleoside analogues used to treat B-CLL, 2-chlorordeoxyadenosine (CdA) and fludarabine, have no significant effect on ATP concentration, we wondered whether their efficacy could be enhanced by combining them with compounds that induce a depletion in ATP. Hence, we tested the effect of glycolysis inhibitors: 2-deoxyclucose (2DG), 2-fluorodeoxyglucose (2FG) and 3-bromopyruvate (3BrPA). We have shown that these three inhibitors were able to inhibit (by more than 80%) glycolysis in leukemic cells. However, ATP reduction and cytotoxicity varied according to the inhibitor.
Next, we combined the different glycolysis inhibitors with CdA or fludarabine and we analyzed the cytotoxicity induced by these combinations. The combination of 2DG, and in a lesser extent, of 3BrPA with nucleoside analogues induced synergic cytotoxicity, suggesting that combination of these compounds with CdA or fludarabine could interesting to treat B-CLL. Conversely, 2FG, yet the most specific glycolysis inhibitor, tended to antagonize the cytotoxicity of nucleoside analogues. This last result suggests that glycolysis inhibition alone cannot explain the synergy observed with 2DG and 3BrPA. Probably other targets have been reached by 2DG and 3BrPA, which allow improving efficacy of nucleoside analogues.
Finally, we investigated the mechanisms of cytotoxicity of glycolysis inhibitors in leukemic cells. We examined whether they induced apoptosis (activation of caspace-3, clivage PARP) and searched whether their cytotoxicity could be counteracted by some means ‘addition of mannose, antioxydants, …). It appeared that the mechanisms of cytotoxicity are different for the three inhibitors, and that their cytotoxicity is not only due to glycolysis inhibition La leucémie lymphoïde chronique de type B (LLC-B) est la plus fréquente des leucémies de l’adulte en Occident. Elle est caractérisée par une accumulation de lymphocytes B matures quiescents qui s’explique principalement par leur résistance à l mort par apoptose. Le traitement consiste en l’administration de cortico-stéroïdes, d’agents alkylants, d’analogues de nucléosides ou d’anticorps monoclonaux, seuls ou en association. Malgré leur efficacité, ces traitements ne peuvent cependant pas guérir les malades. Des résistances apparaissent, soit d’emblée, soit au fil des traitements. Mon laboratoire d’accueil s’intéresse particulièrement au mode d’action des analogues de nucléosides et recherche des stratégies qui permettraient de renforcer leur efficacité.
Mon travail résulte de l’observation d’un chercher de l’équipe, L. Bastin-Coyette, qui a démontré que la lymphotoxicité de la 2-chloroadénosine (un agoniste de l’adénosine non utilisé en clinique) était due en partie à la chute d’ATP qu’il induisait. Comme les analogues de nucléosides utilisés en clinique, la 2-chlorodésocyadénosine (CdA) et la fludarabine, n’ont pas ou peu d’effet sur la concentration d’ATP, nous nous sommes demandé s’il serait possible de renforcer leur efficacité thérapeutique en les combinant à des agents qui font baisser l’ATP. Dans ce but, nous avons testé l’effet d’inhibiteurs de la glycolyse : le 2-désoxyglucose (2DG), le 2-fluorodésoxyglucose (2FG), et le 3-bromopyruvate (3BrPA). Nous avons pu démontrer que ces trois composés inhibaient effectivement la glycolyse dans les cellules leucémiques, mais que la chute d’ATP ainsi que la cytotoxicité qu’ils induisaient variait selon l’inhibiteur utilisé.
Dans une seconde étape, nous avons combiné ces trois inhibiteurs de la glycolyse avec la CdA ou à la fludarabine et analysé la cytotoxicité de ces combinaisons. L’association du 2DG, et dans une moindre mesure du 3BrPA, aux analogues de nucléosides produisait une cytotoxicité synergique dans les cellules de type LLC-B, suggérant que la combinaison de ces inhibiteurs de la glycolyse avec la fludarabine our la CdA pourrait être une thérapie avantageuse pour lutter contre la LLC-B. Au contraire, le 2FG, qui était l’inhibiteur le plus spécifique de la glycolyse, avait plutôt tendance à antagoniser leurs effets. Ce dernier résultat suggère que ce n’est pas l’inhibition de la glycolyse qui potentialise les effets des analogues de nucléosides et que les effets bénéfiques observés en présence de 2DG et 3BrPA résulteraient de l’atteinte d’autres cibles.
Finalement, nous avons investigué les mécanismes de cytotoxicité des inhibiteurs de la glycolyse dans les cellules leucémiques. Nous avons examiné s’ils induisaient de l’apoptose (activation de la caspace-3, clivagede PARP) et recherché s’il existait des moyens de contrecarrer leur cytotoxicité ‘addition de mannose, d’antioxydants, …). Il est apparu que ces trois inhibiteurs agissaient de façon différents, indiquant que leur cytotoxicité n’est pas seulement due à leur capacité d’inhiber la glycolyse

Glycolysis --- Nucleosides --- Leukemia, Lymphocytic, Chronic, B-Cell

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2-Chlorodeoxyadenosine (CdA) is a nucleoside analogue used in the treatment of chronic lymphocytic leukaemia (CLL). This drug is toxic not only for dividing cells, in which it inhibits DNA synthesis, but also for resting cells such as lymphocytes. Recently, the leukaemia cell line EHEB, derived from a patient with CLL, was found resistant to CdA. Paradoxically, CdA increases DNA synthesis in these cells. This finding can be related to the fact that CdA also provokes an activation of thymidine kinase (TK) and of deoxycytidine kinase (dCK), which both play a crucial role in the synthesis of deoxynucleoside triphosphates, required for DNA synthesis. The aim of my work was to learn more on the activation of these enzymes by CdA, and to investigate the mechanism of this activation.
After we had noted that this activation could also be exerted by other nucleosides, we could show that increase of activity by CdA proceeds much more rapidly for dCK than for TK, which suggest that the mechanism of activation by CdA of these two enzymes is different.
Activation of TK by CdA can be suppressed by inhibitors of transcription and of translation which indicates that new synthesis of mRNA and protein are involved in the effect of CdA on TK activity. On the other hand, activation of TK by CdA can also be suppressed by staurosporine, an inhibitor of various protein kinases, suggesting that a protein kinase could mediate the effect of CdA on TK. This yet unidentified protein kinase could influence the transcription of the gene of TK, or increase the activity of TK by post-translational modification.
Activation of dCK by CdA is also strongly decreased by inhibitors of transcription and of translation. However, Western blotting of dCK show that activation of this enzyme by CdA is not explained by an increase of the amount of protein. Contrary to what is observed for TK, activation of dCK, by CdA is only weakly diminished by staurosporine. On the other hand, the effect of CdA on dCK can be mimicked by genistein, a tyrosine kinase inhibitor, suggesting that CdA could act by activating this type of protein kinase. Genistein does not increase TK activity, in accordance with the hypothesis that activation pathways for TK and dCK are different. La 2-chloro désoxyadénosine (ou CdA) est un analogue de la 2’-désoxyadénosine, utilisé dans le traitement de la leucémie lymphoïde chronique (LLC). Elle est toxique non seulement pour les cellules qui prolifèrent, dans lesquelles elle inhibe ka synthèse d’ADN, mais également dans les cellules quiescentes, tels les lymphocytes. Récemment, la lignée leucémique EHEB, dérivée d’une patiente souffrant de LLC, s’est montrée résistante à la CdA. Curieusement, dans ces cellules, la CdA stimule la synthèse d’ADN, ce qui peut être mis en relation avec le fait qu’elle y provoque également une activation de la thymidine kinase (TK) et de la désoxycytidine kinase (dCK), deux enzymes qui jouent un rôle crucial dans la synthèse des désoxynucléoside triphosphates, indispensables à la réplication de l’ADN. Le but de mon travail était d’en savoir plus sur l’activation de ces enzymes par la CdA, et principalement sur le mécanisme de cette activation.
Après avoir remarqué que cette activation pouvait aussi être exercée par d’autres nucléosides, nous avons montré que l’augmentation d’activité de la dCK induite par la CdA était beaucoup plus précoce que celle de le TK, suggérant un mécanisme d’activation différent pour les deux enzymes.
L’activation de la TK provoquée par la CdA peut être supprimée par des inhibiteurs de la transcription et de la traduction, indiquant que cet effet de la CdA fait intervenir une nouvelle synthèse d’ARNm et de protéine. D’autre part, l’effet de la CdA sur la TK est contrecarré par la staurosporine, un inhibiteur de nombreuses protéines kinases, indiquant qu’il pourrait faire intervenir une protéine kinase. Cette protéine kinase, encore non-identifiée, pourrait agir en augmentant l’expression du gène de la TK, ou en produisant une modification post-traductionnelle de l’enzyme.
L’activation de la cDK induite par la CdA est, elle aussi, fortement diminuée par des inhibiteurs de la transcription et de la traduction. Cependant, une analyse par Western blot montre que l’augmentation d’activité de la dCK ne peut être expliquée par une augmentation de la quantité d’enzyme. Contrairement à ce qui est observé pour la TK, l’activation de la dCK par la CdA n’est que faiblement diminuée par la staurosporine. Par contre, elle est mimée par la génistéine, un inhibiteur de protéines-tyrosines kinases, ce qui suggère que le nucléoside pourrait agir par l’intermédiaire de cette enzyme. La génistéine est sans effet sur l’activité de la TK, confirmant que les activités de la TK et de la dCK ne sont pas régulées par les mêmes mécanismes.

Leukemia, Lymphocytic, Chronic, B-Cell --- Thymidine Kinase --- Phosphotransferases

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2-Chloro-2’-deoxyadenosine (CdA), is a nucleoside analogue used in the treatment of B-cell chronic lymphocytic leukaemia (B-CLL). The active metabolite of this compound is the triphosphate derivative CdATP. Accumulation of CdATP inside lymphocytes results in inhibition of DNA synthesis (replication and repair) and in initiation of apoptosis by mechanisms that are not yet entirely clear.
In the leukemic EHEB cell line derived from B-CLL lymphocytes, an unexpected effect of CdA has been observed. Indeed, in this cell line, CdA provokes a stimulation of the progression of cells from G1 to S phase of the cell cycle. This effect has been explained by the activation of Cdk-2, a protein kinase involved in the control of the G1/S transition, but sometimes also in the apoptotic process.
The first objective of my study was to search whether the activation of Cdk-2 elicited by CdA plays a role in the induction of apoptosis. We chose to inhibit Cdk-2 with roscovitine and to analyse its effect on the sensitivity of EHEB cells to CdA. Various assays (MTT, caspase-3, and annexin V) showed that roscovitine reduced the response of cell to CdA, suggesting that activation of the Cdk-2 could indeed contribute to apoptosis induced byCdA in EHEB cells. The following step of the work was to investigate the mechanism of action of Cdk-2 in apoptosis. We discovered that roscovitine strongly reduced the phosphorylation and the stabilisation of the transcription factor p53 caused by CdA. This result leads us to postulate that Cdk-2 could promote apoptosis by increasing p53 phosphorylation and stabilisation.
Finally, we interested in the mechanism by which CdA provokes the activation of Cdk-2. We found that CdA tends to decrease the level of p21, a protein that inhibits Cdk-2 at the G1/S transition, which could explain, at least partially, its activation. La 2-chloro-2'-désoxyadénosine (CdA) est un analogue de nucléoside utilisé dans le traitement de la leucémie lymphoïde chronique de type B (LLC-B). Le métabolite actif de cette molécule est son dérivé triphosphate, le CdATP, dont l'accumulation dans les lymphocytes provoque une inhibition de la synthèse d'ADN (réplication et répartition) et une induction de l'apoptose par des mécanismes encore imparfaitement compris.
Dans la lignée leucémique EHEB, une lignée établie à partir des lymphocytes d'un patient atteint de LLC-B, un effet tout à fait inattendu à été observé. En effet, dans cette lignée, la CdA provoque une stimulation du passage des cellules de la phase G1 vers la phase S du cycle cellulaire. Cet effet est dû à une activation de la Cdk-2, une protéine kinase impliquée dans le contrôle de la transition G1/S, mais parfois aussi dans l'apoptose.
Au cours de mon mémoire, j'ai recherché si l'activation de la Cdk-2 observée en présence de CdA contribuait à l'apoptose induite par cette substance. Pour répondre à cette question, j'ai utilisé un inhibiteur de la Cdk-2, la roscovitine. Les résultats de différents tests (MTT, caspase-3, annexine V) montrent que la roscovitine s'oppose à l'effetr de la CdA, ce qui suggère que l'activation de la Cdk-2 jouerait effectivement un rôle dans l'apoptose induite par la CdA. L'étape suivante fut de rechercher par quel mécanisme la Cdk-2 pourrait favoriser l'apoptose. Nous avons observé que la roscovitine diminue la phosphorylation et la stabilisation du facteur de transcription p53 induite par la CdA. Ces résultats nous amènent àpostuler que la Cdk-2 pourrait agir dans l'apoptose en favorisant l'induction de p53.
Nous nous sommes finalement intéressés au mécanisme d'activation de la Cdk-2 par la CdA. Les résultats obtenus suggèrent que l'activation de la Cdk-2 pourrait être expliquée, du moins partiellement, par la baisse du taux d'un de ses inhibiteurs protéiques, la protéine p21.

Cyclin-Dependent Kinases 2 --- Apoptosis 2'-chloro-2'-deoxyadenosine --- Lymphocytes --- Leukemia, Lymphocytic, Chronic, B-Cell

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B-LYMPHOCYTES --- Leukemia, Lymphocytic, Chronic, B-Cell -- immunology -- Congresses. --- B cells -- Tumors -- Congresses. --- immunology --- immunology. --- Immunology. --- B cells --- Tumors --- Congresses --- Differentiation