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On sélectionne alors les peptides synthétiques qui co-éluent avec des peptides naturels de même masse et on vérifie la séquence des peptides naturels par spectrométrie de masse en tandem. En utilisant cette stratégie, l’équipe du PrHG Rammensee a démontré la présence d’un peptide de MAGE-1, KVLEYVIKV, à la surface d’une cellule tumorale HLA-A2. Aucun CTL ayant une avidité suffisante pour reconnaître une cellule tumorale n’a pu être isolé par cette équipe. L’obtention d’un CTL spécifique n’a rien d’une opération évidente : la fréquence d’un CTL spécifique d’un complexe HLA-peptide donné est probablement de l’ordre de 5x10[-8] dans le sang d’un individu sain. Nous avons décidé d’utiliser des multimères HLA-peptide comme outil d’enrichissement de lymphocytes spécifiques rares.
Un peptide de MAGE-1 reconnu par des CTL sur des cellules tumorales HLA-A2
Un multimère HLA-A2 a été construit avec le peptide de MAGE-1, KVLEYVIKV pour tenter d’isoler un clone de lymphocytes T spécifiques. Dans des expériences préliminaires, un grand nombre de lymphocytes T ont été marqués avec un multimère couplé à un fluorochrome, puis avec un anticorps spécifique du fluorochrome couplé à des billes magnétiques. Après passage dans une colonne entourée d’un champ magnétique, les cellules de la fraction positive ont été triées une seconde fois en cytométrie en flux de façon à sélectionner les lymphocytes T CD8 fortement marquées avec le multimère. Des populations clonales ont été obtenues par stimulations antigénique en mircopuits. Malheureusement, de nombreux clones étaient capables de se lier au multimère, mais seule une petite fraction d’entre eux étaient stimulés par des cellules chargées en peptide ou des cellules tumorales exprimant le gène d’intérêt. Ceci est probablement du au fait que les multimères se lient également à des lymphocytes T qui ont une trop faible affinité pour effectuer leurs fonctions effectrices ou pour transduire un signal menant à une prolifération en présence de cellules présentant le peptide.
Nous avons voulu améliorer la technique dans le but d’isoler uniquement des CTL capables de reconnaître des cellules chargées en peptide et de proliférer. Ces expériences sont décrites dans le chapitre 1. Comme précédemment, un grand nombre de lymphocytes T (170 millions) ont été marqués avec le multimère A2/MAGE-1 couplé à de la phycoérythrine (PE), puis avec un anticorps anti-PE couplé à des billes magnétiques. Les cellules ont ensuite été triées par passage dans une colonne entourée d’un champ magnétique. Au lieu d’isoler directement des précurseurs spécifiques par cytométrie en flux et de les cloner, nous avons distribué les cellules de la fraction positive obtenue par tri magnétique et ainsi enrichie en cellules se liant au multimère, dans 96 micropuits contenant chacun environ 8000 cellules. Ces cellules ont été stimulées avec des cellules dendritiques chargées avec le peptide. Après deux semaines de stimulation, les microcultures ont été testées pour la présence de lymphocytes capables de se lier aux multimères. Seules les microcultures où des lymphocytes T étaient capables de proliférer en présence du peptide plus rapidement que les autres cellules, contenaient suffisamment de lymphocytes marqués par le multimère que pour pouvoir être considérées comme positive. Nous avons ainsi obtenu 11 microcultures positives sur 96. Certaines microcultures ont été clonées et 3 clones indépendants ont été obtenus. Ces clones étaient capables de se lier au tétramère, de lyser des cellules chargées avec le peptide et des cellules tumorales HLA-A2 exprimant MAGE-1. Nous avons donc démontré qu’il existe dans le répertoire des lymphocytes T dirigés contre le peptide de MAGE-1 présenté par HLA-A2 ayant une avidité suffisante que pour reconnaître des cellules tumorales. Des vaccinations thérapeutiques pourraient être menées avec ce peptide chez de nombreux patients : les molécules HLA-A2 sont exprimées par environ 45% de la population caucasienne et asiatique et le gène MAGE-1 dans environ la moitié des mélanomes et des carcinomes de l’œsophage et du poumon.
Un peptide de MAGE-4 reconnu par des CTL sur des cellules tumorales HLA-A24
Dans le cadre d’une collaboration avec un groupe japonais, nous nous sommes efforcés d’identifier des peptides présentés par les molécules HLA-A24, qui sont présentes dans 40% de la population asiatique et 20% de la population caucasienne. Ce travail est décrit dans le chapitre 2. Nous sommes partis de l’observation suivante : un peptide de MAGE-1 avait été décrit comme présenté par HLA-A24 à des CTL. En analysant les séquences des autres protéines MAGE dans la région du peptide MAGE-1.A24, nous avons repéré un peptide MAGE-4 contenant des « motifs d’ancrage » pour HLA-A24. Les antigènes de MAGE-4 sont des cibles intéressantes : MAGE-4 est exprimé dans plus de la moitié des carcinomes de l’œsophage, du poumon, de la vessie, et ceux de la sphère ORL. Le peptide a été synthétisé et s’est révélé capable de se lier à HLA-A24. Nous avons ainsi pu construire un multimère HLA-A24 contenant ce peptide et obtenir un clone CTL spécifique en utilisant le multimère comme outil d’enrichissement ainsi que l’approche décrite ci-dessus. Sur 51 microcultures, 3 contenaient des cellules capables de se lier au tétramère. Un clone qui lysait des cellules présentant le peptide de MAGE-4 a été obtenu. Le clone reconnaissait également des cellules tumorales HLA-A24 exprimant MAGE-4, démontrant par là l’avidité suffisante du CTL et le bon apprêtement du peptide par des cellules tumorales. Cependant, seules les cellules traitées avec de l’IFN-gamma étaient reconnues par le CTL. Cela pourrait être partiellement expliqué par une augmentation d’expression des molécules HLA, un phénomène bien connu en présence d’IFN-gamma. Un autre effet connu de l’IFN-gamma est l’induction de l’expression d’un complexe de protéases impliqué dans l’apprêtement des peptides antigéniques, l’immunoprotéasome. Nos résultats pourraient être interprétés de la façon suivante : les cellules tumorales exprimant des immunoprotéasomes apprêtent mieux le peptide de MAGE-4 que celles exprimant des protéasomes standards présents dans les cellules non –traités à l’IFN-gamma. Des expériences ultérieures sont envisagées pour répondre à cette question. Nous pensons en effet qu’il est important de prendre en compte dans les stratégies vaccinales le fait que des antigènes pourraient être apprêtés de manières différentes selon que l’on soit ou non dans des sites inflammatoires où l’IFN-gamma pourrait être présent Identification de gènes codant des antigènes spécifiques de tumeur
Que notre système immunitaire puisse nous débarrasser de certains cancer est un rêve dont les bases expérimentales datent des années 40. En utilisant des lymphocytes T cytolytiques (CTL) isolés d’une patiente ayant guéri d’un mélanome, le premier gène responsable de l’expression d’un antigène de tumeur humaine a été identifié en 1991. Ce gène, MAGE-1, code une protéine dont un peptide est présenté à la surface de plusieurs types de tumeurs mais pas à la surface des cellules normales. Des cellules cancéreuses présentent donc à leur surface des antigènes, absents des cellules normales, qui peuvent servir de cibles à des CTL capables d’éliminer les cellules cancéreuses. Une série de gènes MAGE ont ensuite été identifiés. Ces gènes, comme le gène MAGE-1, sont exprimés dans un grand nombre de tumeurs de types histologiques variés. Ils sont par contre silencieux dans les cellules normales, à l’exception des cellules du testicule et du placenta, que n’expriment pas de molécules HLA et ne présentent donc pas de peptides aux lymphocytes T. Les antigènes provenant des protéines MAGE paraissent avoir les qualités requises pour servir de vaccin contre les cellules cancéreuses car ils sont présents sur de nombreuses tumeurs, ce qui permettrait d’envisager des vaccins applicables à un grand nombre de patients.
Vaccinations thérapeutiques
Plusieurs essais de vaccinations avec des peptides MAGE ont été achevés. Un peptide MAGE-3 présenté par HLA-A1 a été injecté à des malades porteur de mélanomes métastatiques. Sept patients sur 25 ont montré des régressions tumorales dont trois furent complètes et deux perdurent depuis plus de 4 ans. Par la suite, des vaccins contenant d’autres peptides MAGE, de la protéine MAGE-3, un poxvirus contenant une séquence codant des peptides ont été injectés. On peut conclure de ces essais que les vaccinations sont suivies de régressions tumorales chez une minorité de patients et que, parmi les modalités de vaccination testées, aucune ne semble réellement supérieure aux autres. Assez curieusement, les injections de peptide seul, à priori peu efficace pour stimuler une réponse immunitaire, ne sont pas moins efficaces du point de vue clinique que d’autres modalités.
Proposer un vaccin à un plus grand nombre de patients en identifiant de nouveaux peptides antigéniques
Les différents gènes MAGE codent plus que probablement de nombreux peptides antigéniques présentés par diverses molécules HLA. Il est important de continuer à identifier de nouveaux antigènes de tumeurs. Cela permettra bien sûr de proposer une immunothérapie à un plus grand nombre de patients mais surtout, d’utiliser simultanément plusieurs antigènes dans un seul vaccin. L’expression de l’antigène est souvent hétérogène au sein de la tumeur ; un vaccin multi-peptides pourrait donc augmenter l’efficacité de l’immunisation en diminuant le risque de sélectionner des variants tumoraux ayant perdu l’expression du peptide cible. Pour améliorer les méthodes de vaccination, il est également important d’évaluer le nombre de lymphocytes T anti-MAGE activés par la vaccination. Dans le cas où un peptide est injecté, il est possible d’utiliser un outil spécifique et sensible : un complexe soluble HLA/peptide marqué avec fluorochrome.
Différentes stratégies d’identification de nouveaux peptides MAGE ont été mises en œuvre au laboratoire. Il est possible d’obtenir un grand nombre de cellules dendritiques à partir de monocytes sanguins. Ces cellules dendritiques, considérées comme les cellules les mieux équipées pour activer les lymphocytes T naïfs, peuvent être infectées avec des poxvirus ou des adénovirus contenant la séquence codante d’un gène MAGE et utilisées pour stimuler des lymphocytes T autologues. Les microcultures, et ensuite les clones obtenus à partir des microcultures positives, peuvent être criblées pour leur capacité à lyser spécifiquement des cellules exprimant la protéine MAGE d’intérêt. Le clone anti-MAGE est alors utilisé pour identifier le peptide antigénique reconnu et la molécule HLA qui le présente. La dernière étape est de prouver que le clone CTL a une avidité suffisante pour lyser des cellules tumorales exprimant naturellement le gène MAGE et la molécule HLA. Cette approche, basée sur l’expression d’un gène entier et l’apprêtement de la protéine par des cellules dendritiques, facilité l’identification de peptides qui sont aussi présentés efficacement par des cellules tumorales. Par contre, les peptides identifiés peuvent être présentés par des molécules HLA peu exprimées par la population.
Si l’on veut identifier des peptides antigéniques présentés par des molécules HLA fréquentes, on peut utiliser une autre approche qui consiste dans un premier temps à repérer dans la séquence de la protéine des peptides contenant des acides aminés susceptibles d’ancrer ce peptide dans la molécule HLA. En effet, chaque molécule HLA contient des « poches » spécifiques capables d’accueillir des acides aminés spécifiques. Les peptides choisis en fonction de la présence de ces motifs d’ancrage sont synthétisés et testés pour leur capacité à se lier à la molécule HLA. Les peptides capables de se lier sont alors utilisés pour activer des lymphocytes T reconnaissant spécifiquement le peptide. En utilisant cette approche, le risque est d’isoler les lymphocytes T reconnaissant des cellules chargées en peptide mais incapables de lyser des cellules tumorales exprimant le gène. En effet, il n’existe pas aujourd’hui de bon outil pour prédire les peptides que seront apprêtés efficacement par une cellule tumorale. De rares équipes de recherche ont l’expertise pour démontrer la présence d’un peptide à la surface d’une cellule tumorale. Une stratégie envisagée consiste à synthétiser des peptides candidats et à les analyser par spectrométrie de masse. Parallèlement, des peptides « naturels » sont extraits d’une cellule tumorale, fractionnés par chromatographie HPLC et analysés en spectrométrie de masse.

HLA Antigens --- Antigens, Neoplasm

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Histocompatibility --- HLA Antigens --- Immunogenetics

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Disease Susceptibility --- HLA Antigens --- Registries

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Hla antigens --- Uveitis --- Genetics. --- Anterior --- Immunology.

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HLA Antigens --- Uveitis, Anterior --- genetics --- immunology