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Among vascular anomalies, glomuvenous malformations (GVM) are localized cutaneous lesions, often present at birth and expanding slowly with growth. They are caused by mutations inducing loss of function in the GLOMULIN, which alters the differentiation of vascular smooth muscle cells (VSMCs). Resulting glomus cells have an abnormally rounded shape and do not express some specific markers of vSMC. Dominant inheritrance is explained by the discovery of second-hit mutations wich locally induce complete loss of glomulin in the lesions. By in situ hybridization, the glomulin expression is specific for vascular smooth muscle cells, but its function and regulation of its expression are not yet known. The aim of this work was to find the elements that regulate the spatio-temporal expression of glomulin.
Previously, transgenic mice have been created with a construct (C1) containing the LacZ reporter gene under control of a 5Kb fragment from the region potentially promoter upstream of the ATG of glomulin. In the work reported here, we compared the reporter gene expression with the profile in the conventional KO containing a similar knock-in. In both cases, a vascular staining was found but is not only restricted to vSMC. We hypothesized that a part of intron 2, absent from the two constructs plays a role in regulating expression. Indeed, it is conserved between species and contains binding sites for GKLF, transcriptionnal repressor important in vSMC. Two novel constructs were designed, adding intron 2 downstream of LacZ (C2), or keeping the wild-type context and integrating LacZ after exon 3 (C3). Embryos that will derive from these transgenes should provide answers about the role of this intron. Finally, we also started experiments for overexpression or inhibition of GKLF in vSMC to quantify its effect on glomuline expression by real-time PCR. Therefore, a method of derivation and cultivation of vSMC from mouse aortas was established Parmi les anomalies vasculaires, les malformations glomuveineuses (GVM) sont des lésions cutanées localisées, présentes le plus souvent à la naissance et qui s’étendent lentement avec la croissance. Elles sont causées par des pertes de fonction dans le gène GLOMULINE ce qui altère la différenciation des cellules musculaires lisses vasculaires (vSMC). Les cellules glomiques qui en résultent ont une forme anormalement arrondie et n’expriment pas certains marqueurs spécifiques des vSMC. La transmission suit un mode dominant qui s’explique par la découverte de mutations second-hit induisant une perte locale complète de la glomuline dans les lésions. Il a été montré par hybridation in situ que l’expression de la glomuline est spécifique des vSMC. La fonction et la régulation de la glomuline ne sont pas encore bien connues et ce mémoire a pour but de découvrir des éléments qui contrôlent son expression spatio-temporelle.
Précédemment, des souris transgèniques ont été créées avec une construction (C1) contenant le gène rapporteur LacZ sous contrôle d’un fragment d’environ 5Kb de la région potentiellement promotrice située en amont de l’ATG de la glomuline. Ce mémoire compare le profil d’expression du gène rapporteur dans les lignées transgéniques à celui du KO conventionnel qui contient un knock-in similaire. Dans les deux cas, un marquage vasculaire a été révélé mais celui-ci n’est pas strictement limité aux vSMC. L’hypothèse à été posée qu’une partie de l’intron 2 absente de ces deux constructions jouerait un rôle dans la régulation de l’expression. En effet, cette région est conservée entre plusieurs espèces et contient notamment des sites pour GKLF, un répresseur de transcription important des vSMC. Deux nouvelles constructions ont donc été créées pour ajouter l’intron 2 en aval du gène LacZ (C2) ou en conservant le contexte sauvage et en intégrant le LacZ après l’exon 3 (C3). Les embryons qui en dériveront devraient apporter des réponses quant au rôle de cet intron. Finalement, nous avons réalisé les étapes préliminaires pour une surexpression ou inhibition de GKLF dans les vSMC afin de mesurer, par PCR en temps réel, les conséquences sur l’expression de GLOMULINE. Pour ce faire, une méthode de dérivation de vSMC à partir d’aortes de souris a été mise au point

Myocytes, Smooth Muscle --- Vascular Malformations --- beta-Galactosidase --- GKLF protein