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Gentamicin is an aminoglycoside antibiotic used in clinics to treat severs diseases caused by Gram- bacteria. After glomerular filtration, gentamicin is reabsorbed by endocytose in the proximal tubular cells and accumulated in lysosomes. At therapeutically-relevant doses, it induces apoptosis in vivo in rat kidney. This process has been reproduced in renal cells in culture (LLC-PCK1, MDCK).
As shown by El Mouedden et al (2000b) we confirmed on LLC-PK1 cells that gentamicin accumulation and induction of apoptosis occurred in dose- and time-dependent fashions.
We suggest that gentamicin mediates its apoptotic effect by causing lysosomal membrane destabilization and the subsequent release in the cytosol of lysosomal proteases. We performed therefore fractionation studies of LLC-PK1 cells incubated with gentamicin or MSDH (a well-known agent inducing lysosomal destabilization, [Li et al, 2000]). After 24h of incubation with 2 mM gentamicin, we observed a relocation of acidic hydrolases (such as cathepsin B) in the nuclear fraction and of gentamicin in the supernatant. We observed the same relocation of acidic hydrolases in the nuclear fraction after treatment with MSDH (25Μ during 3h). In this case, however, acidic hydrolases were also found in the supernatant.
Taken all these results, we suggest that the release of lysosomal proteases and gentamicin accumulated in the lysosomes could induce apoptosis directly or via activation of the mitochondrial pathway and/or caspase-3 La gentamicine est un antibiotique de la famille des aminoglycosides qui est utilise en Clinique pour traiter des infections sévères à bactéries Gram-. Après filtration glomérulaire, la gentamicine est réabsorbée au niveau des cellules tubulaires proximales par endocytose puis accumulée dans les lysosomes. A des doses équivalentes aux doses thérapeutiques, la gentamicine induit der l’apoptose in vivo dans le rein des rats. Ce processus a pu être reproduit sur des cellules rénales en culture (LLC-PK1, MDCK).
Après avoir continué, sur des cellules rénales de type LLC-PK1, les résultats obtenus précédemment par El Moudden et al (2000b) montrant l’accumulation de la gentamicine et le nombre de cellules apoptiques dépend à la fois de la concentration en antibiotique (1 à 3 mM) et du temps d’incubation, nous avons montré que la gentamicine provoque une perméabilisation et une relocalisation des hydrolases acides, dont la cathepsine B, au niveau de la fraction nucléaire et de la gentamicine dans le surnageant. Cette perméabilisation est observée après 24 heures d’incubation avec une concentration de 2 mM en antibiotique. Les cellules incubées avec un contrôle positif (MSDH), connu pour induire une perméabilisation du lysosome (Li et al 2000), montrent aussi une perméabilisation avec une relocalisation d’hydrolases acides dans la fraction nucléaire et dans le cytoplasme.
Sur base de nos travaux, nous suggérons que la libération des protéases lysosomiales, soit via une activation de la mitochondrie , de l’activation de la caspase-3 et de l’apoptose induite par la gentamicine

Gentamicins --- Apoptosis --- Lysosomes

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Gentamicin is an antibiotic often essential for the treatment of severe infections due to Gram-negative bacteria, but they cause nephrotoxic reactions. This adverse effect has been attributed to their uptake by endocytosis by proximal tubular cells, their huge accumulation inside the lysosomes of these cells and the development of an array of alterations in proximal tubule epithelium leading to apoptosis. This process was observed after the treatment of rats at low, therapeutically relevant doses but has been reproduced on renal cultured cells (LLC-PK1, MDCK) (El Mouedden et al., 200. Tox. Sci. 56: 229-239; ElMouedden et al., 2000. Antimicrob. Agents Chemother. 44/665-675).
In the present work, we have investigated activation of caspases-3,8 and 9 occurring upon gentamicin-induced apoptosis in LLC-PK1 and the potential role of lysosomal proteases in this process.
We first confirmed that gentamicin induces apoptosis in a dose (1-3mM) and time (4-72h) dependent fashion by measuring the activation of executioner caspase-3. Whatever the concentration of gentamicin used, the activation of caspase-3 at 16 hours.
We then explored the implication of the extrinsic and the intrinsic pathways, by measuring the activation of caspase-8 and 9 respectively. In the presence of 2 mM gentamicin, an activation of caspase-9 only was detected after 12th of incubation, suggesting the involvement of mitochondria pathway on the apoptosis induced by gentamicin upstream to the caspase-3 activation.
Finally, based on the facts that gentamicin is accumulated in the lysosomes and is able to permeabilize the lysosomal membrane ( Servais et al, en preparation), we evaluated, using the DAPI technique, the potential role of lysosomal proteases like cathepsins D and B on the percentage of apoptotic cells in comparison with that observed on cells treated with gentamicin. Using pepstatin A as inhibitor of cathepsin D and and leupeptin as inhibitor of cathepsin B, we showed that inhibition of cathepsin D party reduced the number of apoptotic cells which, in contrast, was slightly increased in presence of an inhibitor of cathepsin B.
Together, these data suggest that gentamicin-induced apoptosis implies both the mitochondrial pathway (resulting in the activation of caspase-9) and the lysosomal pathway (through the pro-apoptotic effect of cathepsin D which is probably released from lysosomes of cells incubated with gentamicin) La gentamicine est un antibiotique appartenant à la famille des aminoglycosides qui est utilisée en thérapeutique pour faire face aux infections graves à bactéries Gram-. Après filtration glomérulaire, la gentamicine est réabsorbée, par un processus d’endocytose, au niveau des cellules du tubule proximal où elle s’accumule dans les lysosomes. A des doses équivalentes à des doses thérapeutiques, la gentamicine induit de l’apoptose in vivo dans les reins de rats traités. Ce processus a pu être reproduit sur plusieurs types cellulaires dont les cellules rénales LLC-PK1 et MDCK.
Des études antérieures ont démontré l’importance de l’accumulation cellulaire de la gentamicine pour le développement du processus apoptique ainsi qu’un effet du temps d’incubation (1 à 3 jours) et de la concentration extracellulaire en gentamicine (1 à 3 mM). Pour évaluer le processus d’apoptose induit par la gentamicine, nous avons dosé l’activité de la caspase-3 (caspase exécutrice) pour différents temps d’incubation (de 4 à 72 h) avec des concentrations en gentamicine de 1 à 3 mM et avions confirmé l’effet temps et l’effet concentration. Quelque soit la concentration en gentamicine utilisée, m’activation des caspases-3 débute à 16 heures.
Par la suite, nous avons cherché à savoir quelle(s) voie(s) signalétique(s) étai(en)t responsable(s) de l’activation de la caspase-3. Les résultats obtenus ont montré, dés 12 heures, une activation de la caspase-9, caspase’ initiatrice de la voie mitochondriale/ intrinsèque. Afin de déterminer le mécanisme par lequel cette voie était activé, nous avons étudié le rôle potentiel des cathepsines B et D dans l’apoptose induite par la gentamicine. Des études menées en parallèle ont montré la capacité de la gentamicine à perméabiliser le lysosome, suggérant que des protéases lysosomiales pourraient être relarguées dans le cytosol et activer directement ou indirectement la mitochondrie. Les résultats obtenus en utilisant la leupeptine et la pepsatine A comme inhibiteurs des cathepsines B et D semblent indiquer que la cathepsine D jouerait un rôle dans l’apoptose induite par le gentamicine alors que la cathepsine B préviendrait ce processus.
Sur base de nos travaux et d’observations réalisées en parallèle au laboratoire, nous proposons que l’apoptose induite par la gentamicine dans les cellules LLC-PK1 serait initiées par une perméabilisassions de la membrane du lysosome, entraînant un relargage de protéases lysosomiales et de gentamicine qui seraient responsables de l’activation directe ou indirecte de la mitochondrie. Cette cascade entraînerait l’activation de la caspase-3 menant aux phénomènes d’apoptose induit par la gentamicine

Gentamicins --- Caspases --- Cathepsins --- Apoptosis

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La survenue d'une péritonite aiguë demeure une complication sévère de la dialyse péritonéale (DP). L'administration rapide d'antibiotiques, sans délais, permet d'en obtenir la guérison. L'administration intra-péritonéale (IP) des antibiotiques est compliquée et comporte le risque d'ajouter de nouveaux germes dans la cavité péritonéale; l'administration d'antibiotiques IP également a été associée à une péritonite chimique. Le but de cette étude est d'évaluer l'efficacité et la sécurité d'une administration systémique (intraveineuse et orale) de Vancomycine, Ciprofloxacine et Gentamicin chez les patients ayant une péritonite aïgue aux Cliniques Universitaires Saint-Luc entre le 01/01/2000 et le 30/06/2014, et d'identifier les facteurs associés à l'échec du traitement.Nous avons rétrospectivement identifié tous les épisodes de péritonite aïgues chez les patients en dialyse péritonéal aux Cliniques Universitaires Saint­ Luc entre le 01101/2000 et le 30/06/2014. La Vancomycine est administrée à la posologie a été injectée 20 mg/ kg de poids par voie intraveineuse, la Ciprofloxacine ,oralement, 250 mg deux fois par jour (500 mg deux fois par jour si la clairance de la créatinine résiduelle était supérieure à 3 ml / mn) et Gentamycine 80mg (l'ajout de Gentamycine a commencé à partir de 1/6/2009), dose unique, intraveineuse, au moment du diagnostic de la péritonite. Les caractéristiques démographiques, biochimiques et microbiologiques des patients. ont été enregistrées. Les résultats ont été défini en "premier" (Vancomycine/ Ciprofloxacine) ou "second" (Vancomycine/ Ciprofloxacine/ Gentamycine) protocole. L-e success du traitement a été define avec la guérison de la péritonite en première intention (Gl) ou après adaptation des antibiotiques (G2). L'échec du traitement ont été défini comme le décès du patient dû à une péritonite, le nécessité du retrait du cathéter ou la rechute de péritonite. Les épisodes de mauvais résultats ont été comparés avec ceux d'une réussite du traitement.175 épisodes de péritonite sont survenus chez 89 patients au cours de la période d'étude; 35 elpisodes de péritonite n'ont pas été inclues dans l'étude (33 violations de protocole et 2 patients perdus de vue); permettant donc d'analyser 140 épisodes de péritonite chez 86 patients. Cinquante et une (36,4%) péritonites étaient dûes à Gram positif et 37 (26,4%) à Gram-négatifs se sont dévéloppé, l'absence organisme identifié ne représentaient que 17,9% de tous les épisodes de péritonite, alors que 19,3% des péritonites étaient polymicrobiens . Le taux global de succès du traitement a été de 73,6% (71,7% avec le premier protocole et 79,4% avec le deuxième protocole). Un nombre de globules blancs > 1700 cellules/ µl le 3ème jour de la péritonite prédit l'échec du traitement avec une sensibilité de 61,1% et une spécificité de 96,1%. En comparison avec les données associées à un bon prognostics , les facteurs associés à de mauvais résultats sont de plus grand âge (61,28 vs 52,37, p = 0,02), un comorbidité de Charlson score plus élevé (moyenne 5,62 vs 4.41 , p = 0,007), la présence de diabète (34,4% vs 18,5%, p = 0,09), des niveaux de CRP plus élevée après 3 jours de traitement (16,34 vs 8,26 mg/dl, p = 0,003), une numération de globules blancs plus élevée dans le dialysat au jour de l'admission (6604 vs 4879/µl, p = 0,02) et après 3 jours de traitement (4368 vs 395/µl, p <0,0001), la durée nécessaire du traitement (32,17 vs 21,16 jours , p = 0,003) et un nombre prolongés de jours d'hospitaiisation (17,41 vs 2,39 jours, p <0,0001)L'administration systémique de vancomycine , ciprofloxacine et la gentamicine est un protocole de première ligne d'antibiothique simple et efficace pour traiter la péritonite dialyse péritonéale. Les facteurs associés à un mauvais pronostic sont l'âge, un score de Charlson élevé, la presence d'un diabète, un taux élevé de CRP, un nombre élevé_ de globules blancs dans le dialysat, une durée prolongée de !'antibiothérapie et un nombre élevé de jours hospitalisatione . La numération des globules blancs dans le dialysat au 3ème jour de la péritonite semble être un paramètre non-invasif et prometteur pour prédire le pronostic de la péritonite en dialyse péritonéale. Acute peritonitis remains an important complication of peritoneal dialysis (PD). It requires prompt antibiotic administration. The usual intra-peritoneal (IP) antibiotic administration is cumbersome and carries the risks of adding new germs into the peritoneal cavity; also, IP administration of antibiotics has been associated with chemical peritonitis. The aim of this study is to review both the efficacy and safety of our protocol of systemic (intravenous and oral) administration of Vancomycin, Ciprofloxacin and Gentamycin in PD patients with acute peritonitis from Cliniques Universitaires Saint-Luc, Brussels,between 0110 1/2000 and 30/06/2014 and to identify factors associated with treatment failure.We retrospectively identified all PD-related peritonitis episodes at our center between 01/01/2000 and 30/06/2014. Vancomycin 20 mg/kg body weight, intravenous, Ciprofloxacin 250 mg two times per day (500 mg twice per day if residual creatinine clearance was above 3 mL/mn) and Gentamycin 80 mg (Gentamycin was started from 116/2009 onwards), single dose, intravenous were prescribed at the diagnosis of peritonitis . Results were divided into a "first" (Vancomycin/ Ciprofloxacin) and a "second"(Vancomycin/ Ciprofloxacin/ Gentamycin) protocol. Demographic, biochemical and microbiological data were recorded, for all patients. Successes of the protocol were defined as the cure of the infections, at the first intention (G 1) or after antibiotic adaptation (G2). Failure treatment was defined as death due to peritonitis, catheter removal or relapse peritonitis. Episodes with poor outcomes were compared with those with that were successfully cured.Results: A total of 175 peritonitis episodes occurred in 89 patients were enrolled during the study period; 35 peritonitis episodes were not included in the study (33 protocol violation and 2 patients lost for follow-up); giving 140 episodes of peritonitis in 86 patients. Fifty-one (36.4%) gram-positive and 37 (26.4%) gram-negative organisms were grown respectively, no organism identified accounted for 17.9% of ail peritonitis episodes, whereas polymicrobial peritonitis occurred in were 19.3%. The overall treatment success rate was 73.6% (71.7% with first protocol and 79.4% with second protocol). The dialysate total white cell (WC) count on day 3 of peritonitis with a cut point > 1700 cells/ µl predicted treatment failure with a good sensitivity of 61,l% and excellent specificity 96,1%. As compared to factors associated with a good prognosis, factors associated with poor outcome were increased age (61 vs 52, p=0.02), higher Charlson's score (mean 4.41 vs 5.62, p=0.007), diabetes (34.4% vs 18.5%, p=0.09), with higher serum CRP levels after 3 days of treatment (16.34 vs 8.26 mg/dl, p = 0.003), higher white cell counts in dialysate at day of admission (4879 cells/µl vs 6604 cells/µl, p=0.02) and after 3 days of treatment (395 cells/µ1 vs 4368 cells/µ1, p<0.0001), longer duration of antibiotic therapy (21.16 vs 32.17 days, p=0.003) and prolonged days of hospitalization (2.39 vs 17.41 days, p<0.0001)Systemic vancomycm, ciprofloxacin and gentamicin administration is a simple and efficient first-line protocol antibiotic therapy for PD peritonitis. Factors associated with poor outcome are older age, high comorbidity Charlson's score, diabetes, high CRP level, high dialysate white cell count, longer duration of antibiotic therapy and prolonged days of hospitalization. Dialysate white cell count at day 3 of peritonitis is confirmed to be a non-invasive and promising parameter to predict outcomes of dialysis-related peritonitis.

Peritoneal Dialysis --- Vancomycin --- Gentamicins --- Ciprofloxacin

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A l'heure actuelle, les aminoglycosides ont regagné de l'intérêt tant pour leur efficacité contre les bactéries résistantes aux autres classes d'antibiotiques, que pour leurs effets prometteurs dans le traitement d'affections virales et génétiques. Malheureusement, leur néphrotoxicité constitue encore un frein à leur utilisation. Les aminoglycosides sont éliminés par filtration glomérulaire et en partie réabsorbés par les cellules tubulaires proximales où leur accumulation est toxique. A doses thérapeutiques, cette toxicité se manifeste par un processus apoptotique dans les reins des rats traités, processus reproduit dans des cellules tubulaires proximales de type LLC-PKl.Dans ce contexte, nous avons cherché à améliorer la compréhension des mécanismes cellulaires et moléculaires responsables de l'apoptose induite par la gentamicine dans les cellules LLC-PKl.Dans une seconde partie de notre travail, nous nous sommes intéressés au rôle du réticulum endoplasmique dans le processus apoptotique induit par la gentamicine.Nous avons observé par western blot l'activation de deux marqueurs de stress du réticulum endoplasmique : elF2a et lacaspase-12..Notre travail apporte quelques pièces permettant de compléter, petit à petit, le puzzle que constituent les mécanismes intracellulaires de l'apoptose induite par la gentamicine. Nowadays, aminoglycosides regain interest for their effectiveness against bacteria resistant to other classes of antibiotics, as well as for their promising activity in the treatment of viral and genetic diseases . Unfortunately, these antibiotics are responsible for a nephrotoxicity that limits their clinical use. Aminoglycosides are eliminated by glomerular filtration and partially reabsorbed by proximal tubular epithelial cells where their accumulation can be taxie. At therapeutic doses, this toxicity appears by apoptosis in kidneys of treated rats. This process has been reproduced in LLC­ PKl cultured cells. In this context, we tried to improve the comprehension of cellular and molecular mechanisms involved in gentamicin-induced apoptosis in LLC-PKl cells.ln the first part of this work, we explored the p53 pathway as a possible link between lysosomal membrane permeabilization highlighted by Denamur et al. and activation of mitochondrial pathway of apoptosis observed by Servais and colleges. The p53 inhibitor pifithrin-a offers a partial protection towards gentamicin induced-apoptosis, which suggests a potential role for p53 in this process.ln the second part of this work, we focused our interest on the raie of endoplasmic reticulum in the apoptosis induced by gentamicin. By western blotting, we noticed the activation of two endoplasmic reticulum stress markers : elF2a and caspase-12.We brought some pieces of the puzzle made up of intracellular mechanisms of gentamicin induced­ apoptosis.

Apoptosis Regulatory Proteins --- Gentamicins --- Genes, -P53

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KIDNEY FAILURE, CHRONIC --- MICROBIAL SENSITIVITY TESTS --- STAPHYLOCOCCUS EPIDERMIDIS --- GENTAMICINS --- KIDNEY FAILURE, ACUTE --- KIDNEY FAILURE, CHRONIC --- MICROBIAL SENSITIVITY TESTS --- STAPHYLOCOCCUS EPIDERMIDIS --- GENTAMICINS --- KIDNEY FAILURE, ACUTE