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Deoxycytidine kinase (dCK) catalyses the rate-limiting reaction in the salvage of deoxyribonucleosides, supplying cells with dNTPs for DNA synthesis. The enzyme phosphorylates deoxycytidine , désoxyguanosine and deoxyadenosine, with ATP as phosphate donor. In addition, dCK activates number of nucleoside analogues used in the treatment of lymphoproliferative disorders and viral infections. Studies of the mechanisms that control the activity of this enzyme are thus of particular interest. Recently, C. Smal, a graduate student of our team, has identified four phosphorylation sites on human dCK overexpressed on HEK 293T cells : Thr3, Ser11, Ser15 and Ser74. By site-directed mutagenesis, she has demonstrated that Ser74 phosphorylation in crucial for dCK activity.
The aim of my work was to investigate whether Thr3 and Ser11 phosphorylation influences dCK activity. First, we improved the purification of dCK expressed as a His-tag fusion protein. Then, we confirmed that the kinetic characteristics of the recombinant dCK were similar to those of the native enzyme, despite the presence of the His tag. Moreover, we showed that dCK treatment with λ protein phosphatase profoundly decreased dCK activity, corroborating that the recombinant enzyme was phosphorylated.
The following step was a site-directed mutagenesis study, HEK 293T cells were transferred with mutated versions of His-tagged dCK. Thr3 and Ser11 were mutated both to Ala (T3A and S11A mutants) to eliminated the possibility of phosphorylation of this residue. We found that these mutations provoked a decrease of dCK activity, which was particularly pronounced for the T3A mutant. However, the decreases in dCK activity were approximately parallel to the decrease in protein expression. Affinity of dCK mutants for désoxycytidine was not modified. Theses results indicate that Thr3 and Ser11 phosphorylation does not control dCK activity, but could influence its expression or stability La désoxycytidine kinase (dCK) catalyse la phosphorylation de la désoxycytidine, de la désoxyadénosine et de la désoxyguanosine, et initie ainsi la formation de dNTPs, indispensables à la synthèse de l’ADN. En plus de ce rôle physiologique, la dCK active plusieurs analogues de nucléosides utilisés dans le traitement de désordres lymphoprolifératifs et d’infections virales, d’où l’intérêt porté à cette enzyme par les biochimistes. Récemment, une doctorante du laboratoire ; C. Smal, a identifié quatre sites de phosphorylation sur la dCK humaine, après surexpression dans les cellules HEK 293T : la Thr3, et les Ser11, 15 et 74. Elle a montré aussi par mutagenèse dirigée que la phosphorylation de la Ser74 était cruciale pour l’activité de la dCK.
L’objectif principal de mon travail était d’examiner si la phosphorylation de la Thr3 et de la Ser11 influençait l’activité de la dCK. Nous avons commencé par optimiser la méthode de purification de la dCK surexprimée avec une étiquette polyhistidine. Nous avons ensuite confirmé que les caractéristiques cinétiques de l’enzyme recombinante étaient comparables à celles rapportées dans la littérature, malgré la présence de l’étiquette polyhistidine. Finalement, nous avons montré que le traitement de l’enzyme recombinante avec la protéine phosphatase lambda diminuait fortement son activité, ce qui confirmait que l’enzyme recombinante était bien phosphorylée.
Nous avons poursuivi notre étude de mutagenèse dirigée. Des mutations ont été introduites au niveau des Thr3 et Ser11 de la dCK. Ces deux acides aminés ont été remplacés soit par une alanine, ne pouvant être phosphorylée, soit par un acide glutamique mimant la charge négative du groupe phosphate. Les quatre mutants ont été exprimés dans les cellules HEK 293T. Leur analyse a montré que l’activité de la dCK était abaissée à des degrés divers par les différentes mutations, et particulièrement par la mutation T3A. toutefois, les baisses d’activité observées étaient parallèles à une diminution de l’expression protéique. Le Km de la dCK, quant à lui, n’était pas modifié par les mutations. Ces résultats suggèrent que la phosphorylation de la Thr3 et de la Ser11 n’influence pas les propriétés cinétiques de la dCK, mais qu’elle pourrait influencer l’expression ou la stabilité de l’enzyme.

Phosphothreonine --- Serine --- Mutagenesis, Site-Directed --- Deoxycytidine

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Deoxycytidine kinase (dCK) catalyzes the phosphorylation of deoxycytidine, deoxyadenosine and deoxyguanosine, using ATP or UTP as phosphate donor. This is the rate-limiting reaction in the salvage of deoxyribonucleosides, which supplies cells with dNTPs for DNA synthesis. In addition, dCK phosphorylates and activates a number of nucleoside analogues used in anticancer and antiviral chemotherapy. Studies of the mechanisms that control the activity of the enzyme are thus of particular interest. Recently, it has been demonstrated in our lab that dCK is a phosphoenzyme containing at least four phosphorylation sites. Moreover, phosphorylation of Ser-74 was found to be essential for the control of dCK activity. However, the signalling pathway leading to the phosphorylation and the activation of dCK is not known yet.
The first objective of my study was to analyze in EHEB cells whether GSK-3 was implicated in the regulation of dCK. Indeed, TDZD-8, a specific inhibitor of GSK-3, was able to suppress the activation of dCK induced by the nucleoside analogue 2-chloro-2’-deoxyadenosine (CdA). First, we have shown that TDZD-8 also reduced the activation of dCK induced by several other genotoxic agents, such as genistein and aphidicolin. However, other inhibitors of GSK-3, such as Li+ and alsterpaullone, were unable to reduce dCK activation by CdA or others agents, despite the fact that they were found to inhibit GSK-3 in vitro as well as in intact cells. These results disagreed with a role of GSK-3 in the regulation of dCK activity. This conclusion was strengthened by our observation that CdA, which activates dCK, did not modify GSK-3 activity. Moreover, GSK-3 was not able to phosphorylate recombinant dCK in vitro. Concerning the TDZD-8, we have shown that its effect in intact cells could neither be explained by a direct effect on dCK activity nor by inhibition of CdA metabolism. Thus, we suggest that TDZD-8 reduces dCK activation not via inhibition of GSK-3, but via inhibition of another protein kinase that remains to identify.
The second step of our study was to examine whether the transcription factor p53 was involved in the regulation of dCK activity. Indeed, it had been reported that pifithrin-, a pharmacological inhibitor of p53, abolished the activation of dCK by CdA. The hypothesis of a role of p53 in the control of dCK activity was attractive because the majority of the agents that activate dCK are genotoxic and induce p53 activation. However, the effect of pifithrin- reported in the literature was not reproduced in our lab. Moreover, we showed that elevation of p53 was not always followed by an activation of dCK. Finally, we noted that inhibition of protein kinases responsible for the phosphorylation and the activation of p53 did not affect dCK activation by CdA. Taken together, these results indicate that the p53 pathway is not involved in the control of dCK activity. La désoxycytidine kinase (dCK) catalyse la phosphorylation de la désoxycytidine, de la désoxyadénosine et de la désoxyguanosine, l'étape limitante de la voie de récupération des désoxynucléosides qui mène à la formation des dNTPs, précurseurs de l'ADN. En plus de ce rôle physiologique, la dCK phosphoryle et active un grand nombre d'analogues de nucléosides utilisés en chimiothérapie anticancéreuse et antivirale, d'où l'intérêt porté à cette enzyme. Il a été récemment démontré au laboratoire que l'activité de la dCK était régulée par phosphorylation, en particulier de la Ser-74. La voie de signalisation qui mène à la phosphorylation et l'activation de la dCK n'est cependant pas encore élucidée.
Le premier objectif de mon travail était d'analyser si la GSK-3 était impliquée dans la régulation de l'activité de la dCK. En effet, un inhibiteur spécifique de cette protéine kinase, le TDZD-8, était capable de supprimer l'activation de cette enzyme provoquée par l'analogue de nucléoside 2-chloro-2'-désoxyadénosine (CdA). Nous avons commencé par montrer que le TDZD-8 supprimait aussi l'activation de la dCK induite par d'autres agents génotoxiques, comme la génistéine et l'aphidicoline. Malheureusement, ces effets ne purent être reproduits par d'autres inhibiteurs de la GSK-3 (Li+, alsterpaullone, SB-216763), qui pourtant semblaient efficaces aussi bien in vitro que dans la cellule intacte. Ces résultats mettaient en doute un rôle de la GSK-3 dans la régulation de la dCK. D'autre part, la GSK-3 n'est pas capable de phosphoryler directement la dCK recombinante in vitro. De plus, la CdA qui active la dCK ne modifie pas l'activité de la GSK-3, ainsi que nous l'avons constaté après avoir mis au point le dosage de cette protéine kinase. Nous en concluons qu’il est peu probable que la GSK-3 joue un rôle dans la régulation de l'activité de la dCK. Quant à l'effet du TDZD-8, nous avons montré qu'il ne peut s'expliquer ni par un effet direct sur l'activité de la dCK, ni par une inhibition du métabolisme de la CdA. Nous suggérons qu'il inhibe une autre protéine kinase que la GSK-3, qui serait elle réellement impliquée dans le contrôle de l'activité de la dCK.
Le second objectif de mon travail était d'examiner si le facteur de transcription p53 jouait un rôle dans la régulation de l'activité de la dCK. La littérature rapportait en effet que l'activation de la dCK par la CdA était supprimée par la pifithrin-, un inhibiteur de l'activité transcriptionnelle de p53. Cette hypothèse était plausible puisque la plupart des agents qui activent la dCK sont génotoxiques et activent p53. D'une part, l'effet de la pifithrin- décrit dans la littérature n'a pu être reproduit au laboratoire. D'autre part, nous avons montré que l'activation de p53 n'était pas toujours suivie d'une activation de la dCK. Finalement, l'inhibition des protéines kinases responsables de la phosphorylation et de l'activation de p53 n'affecte pas l'activation de la dCK. Ces résultats suggèrent que la voie p53 n'est pas impliquée dans le contrôle de l'activité de la dCK.

glycogen synthase kinase 3 beta --- Tumor Suppressor Protein p53 --- Deoxycytidine Kinase --- Dideoxyribonucleases --- Humans --- Tumor Cells, Cultured --- Leukemia, Lymphoid