Abstract | Keywords | Export | Availability | Bookmark

Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

The MAGE-A family of human genes encodes tumor antigens which may be the target of an immune response driven by T lymphocytes CD8+. In normal somatic cells, these genes are only expressed in spermatogonia. They are also activated in various kinds of cancers. The function of MAGE-A proteins is still largely unknown.
Several studies providing from different laboratories (including Ludwig Institute in Brussels), have shown that MAGE-A1 proteins can interact with histone desacetylases in order to inactivate the expression of transgenes or genes regulated by p53. Moreover, it has been shown in our laboratory that MAGE-A1 protein easily interacts in co-immunoprecipitation with the DNA methyltransferases DNMT3A and DNMT3B.
The aim of this work was to analyse the role of the interaction between MAGE-A1 protein and the endogenous DNA methyltransferases. We wanted to test if MAGE-A1 is able to recruit an endogenous DNA methyltransferase and to modify the expression of an exogenous gene, Luc, encoding a luciferase. The U2OS cells have been chosen as recipient cells because of they express a high level of DNMT3A and DNMT3B.
To reach this purpose, a hybrid protein made of Gal4 binding domain and MAGE-A1 (Gal4bd/MAGE-A1) has been used because it is able to bind to the fixation site of Gal4. This fixation site is found upstream of the promoter of the exogenous gene Luc. We used as a negative control a protein which included only the Gal4 binding domain. Once clones stably expressing Gal4bd/MAGE-A1 or Gal4bd had been obtained, we transfected the reporter gene pGal4tkLuc. The number of integrated copies of the plasmid pGal4tkLuc was evaluated: it reached 2 copies per cell in the population expressing Gal4bd/MAGE-A1 and 0,1 copy per cell in the population expressing Gal4bd. We assessed the luciferase activity from the reporter gene and, by using the sodium bisulfite method, we determinate the methylation status of the exogenous promoter and of adjacent sequences.
The results indicate a decrease of luciferase activity on the long term: 45 days after transfection, luciferase activity decreases from a factor 26 or 123 in the populations expressing Gal4bd/MAGE-A1 while it didn’t vary that much in the population expressing Gal4bd.
Furthermore, we noticed a difference of methylation level within the promoter sequence after 45 days: while only 6,7% of CpG appeared to be methylated in the controls cells expressing Gal4bd, 22% of CpG were methylated in cells expressing Gal4bd/MAGE-A1. These results confirm our work hypothesis: MAGE-A1 seems to be able to recruit an endogenous DNMT. This allows the methylation of an exogenous promoter and induces the repression of the reporter gene controlled by promoter La sous-famille des gènes humains MAGE-A code des antigènes tumoraux qui peuvent être la cible d'une réponse immunitaire par les lymphocytes T CD8+. Dans les cellules normales, les gènes MAGE-A ne sont exprimés que dans les spermatogonies et, dans une moindre mesure, dans le placenta. Ils sont exprimés également dans de nombreux types de tumeurs. La fonction des protéines MAGE-A reste en grande partie inconnue. D'après les études réalisées dans différents laboratoires (dont celui de l’Institut Ludwig de Bruxelles), les protéines MAGE-A peuvent interagir avec des histones désacétylases pour réprimer l'expression de transgènes ou de gènes régulés par p53. De plus, il a été montré dans notre laboratoire que la protéine MAGE-A1 peut être facilement co-immunoprécipitée avec les DNA méthyltransférases Dnmt3a et Dnmt3b.
L'objectif de nos investigations est de mettre en évidence, dans un type cellulaire particulier, le rôle de cette interaction entre la protéine MAGE-A1 et les DNA méthyltransférases. Nous avons donc voulu tester si MAGE-A1 était capable de recruter une DNA méthyltransférase endogène pour modifier l'expression d'un gène exogène, le gène Luc codant la luciférase. Les cellules U2OS ont été choisies parce qu'elles expriment des quantités élevées de Dnmt3a et Dnmt3b endogènes. Une protéine hybride constituée du domaine de liaison à l'ADN de Gal4 fusionné à MAGE-A1 (Gal4bd/MAGE-A1) a été utilisée parce qu’elle peut se lier au site de fixation de Gal4 cloné en amont du promoteur du gène Luc. Le contrôle négatif utilisé comprenait seulement la protéine de liaison à l'ADN de Gal4. Après avoir obtenu des clones exprimant Gal4bd/MAGE-A1 ou Gal4bd de façon stable, nous avons transfecté le plasmide rapporteur pGal4tkLuc. Le nombre de copies de plasmide pGal4tkLuc intégré était en moyenne de deux copies par cellule pour les populations exprimant Gal4bd/MAGE-A1 et de 0,1 copie par cellule pour la population exprimant Gal4bd. Nous avons évalué l'activité luciférase du gène rapporteur et nous avons déterminé, par la méthode au bisulfite de sodium, l'état de méthylation du promoteur exogène ainsi que des séquences adjacentes.
Les résultats obtenus montrent une diminution de l'activité luciférase à long terme : 45 jours après la transfection, l'activité luciférase diminue d'un facteur 26 à 123 dans les populations exprimant Gal4bd/MAGE-A1 tandis qu'elle varie très peu dans la population exprimant Gal4bd. Au niveau de la méthylation après 45 jours, on voit une différence du pourcentage des CpG méthylés dans la séquence : ce pourcentage est de 6,7% pour le contrôle exprimant Gal4bd tandis qu'il atteint la valeur de 22% pour les cellules exprimant Gal4bd/MAGE-A1. Ces résultats sont en accord avec notre hypothèse de travail : MAGE-A1 semble capable de recruter une Dnmt endogène pour permettre la méthylation d'un promoteur exogène et donc la répression du gène rapporteur sous l'influence de ce promoteur

MAGEA1 protein, human --- DNA Methylation --- DNA Modification Methylases --- Melanoma --- Melanoma --- Neoplasms