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DNA METHYLATION --- DNA METHYLATION

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Dna methylation --- Dna methylation

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Telomeres are ribonucleoproteic structures which protect chromosome ends from exonucleolytic degradation and inter-chromosomic fusions. In somatic cells, telomere length decreases with each cell division, thereby limiting their proliferation potential. In most cancer cell lines, telomere length is maintained by a ribonucleoprotein complex called telomerase, allowing cells to proliferate indefinitely (TEL+ cells). However, some telomerase-deficient cancer cell lines use an alternative mechanism of telomere maintenance (ALT cells). This mechanism, based on homologous recombination between telomeric repeats, is characterized by high rates of telomeric sister chromatid exchanges (T-SCE) but remains poorly understood.
Methylation is the only known epigenetic modification of DNA. In mammals, DNA is methylated on CpG dinucleotides, mainly located within repetitive sequences (pericentromeric and subtelomeric regions), as well as in some gene promoters. Recent studies have shown that mouse stem cells lacking DNA methyltransferase exhibit a reduced level of subtelomeric DNA methylation, heterogeneous telomere lengths and higher rates of T-SCE. Similar observations have been made in mouse cells lacking telomerase, suggesting the existence of a link between subtelomeric DNA methylation level and telomere dynamics.
To investigate the possible impact of subtelomeric DNA methylation level on the rate of T-SCE in human cell lines, we analysed subtelomeric DNA methylation levels in ALT and TEL+ cancer cell lines. We detected a lower methylation level in ALT cells, but this subtelomeric DNA hypomethylation was not observed in ALT fibroblasts derived from in vitro immortalization with SV40T. This suggests that subtelomeric DNA hypomethylation is not required for ALT mechanism.
Next, we started to investigate the impact of telomerase on subtelomeric DNA methylation in human cancer cell lines. To this end, we analysed subtelomeric methylation levels: 1) in ALT cells transfected with the telomerase catalytic subunit-encoding gene (hTERT); 2) in TEL+ cells, with low subtelomeric DNA methylation, overexpressing hTERT; and 3) in cellular hybrids between ALT and TEL+ cells. We also checked if subtelomeric DNA remethylation could be observed in TEL+ cancer cells that had been treated with a DNA demethylating agent Les télomères sont des structures nucléoprotéiques chargées de protéger l’extrémité des chromosomes des dégradations exonucléasiques et des fusions inter-chromosomiques. Dans les cellules somatiques, les télomères s’érodent au fil des divisions cellulaires, limitant ainsi leur potentiel de prolifération. Dans la majorité des lignées cancéreuses, la longueur de leurs télomères est maintenue grâce à un complexe ribonucléoprotéique appelé télomérase, ce qui leur permet de proliférer indéfiniment (lignées TEL+). Cependant, certaines lignées cancéreuses dépourvues de télomérase utilisent un mécanisme alternatif de maintien des télomères (cellules ALT). Ce mécanisme, basé sur des recombinaisons homologues, est caractérisé par des taux élevés d’échanges entre chromatides sœurs au niveau des télomères (T-SCE) mais reste encore mal compris.
La méthylation est la seule modification épigénétique de l’ADN connue. Chez les mammifères, l’ADN est méthylé au niveau de dinucléotides CpG, principalement situés dans des séquences répétitives (régions péricentromérique et subtélomérique) et dans les promoteurs de certains gènes. De récentes études ont montré que des cellules souches de souris déficientes en DNA méthyltransférase présentent une diminution de la méthylation de l’ADN subtélomérique, des longueurs de télomères hétérogènes et des taux accrus de T-SCE. Des observations similaires ont été faites dans des cellules murines déficientes en télomérase, ce qui suggère qu’il existe un lien entre le niveau de méthylation de l’ADN subtélomérique et la dynamique des télomères.
Afin de tester l’impact éventuel du niveau de méthylation de l’ADN subtélomérique sur le taux de T-SCE dans des lignées humaines, nous avons analysé le niveau de méthylation subtélomérique dans des lignées cancéreuses humaines ALT et TEL+. Nous avons détecté un niveau de méthylation plus bas dans les cellules ALT, mais cette hypométhylation subtélomérique ne s’est pas observée dans des lignées de fibroblastes ALT issus de l’immortalisation in vitro par SV40T. Ceci suggère qu’une hypométhylation de l’ADN subtélomérique n’est pas requise pour le mécanisme ALT.
Nous avons ensuite entamé l’étude de l’influence de la télomérase sur la méthylation de l’ADN subtélomérique dans des lignées cancéreuses humaines. Pour cela, nous avons analysé le niveau de méthylation subtélomérique : 1) dans des lignées ALT transfectées avec le gène encodant la sous-unité catalytique de la télomérase (hTERT) ; 2) dans des hybrides cellulaires entre cellules cancéreuses ALT et TEL+; et 3) dans des cellules TEL+ dont l’ADN subtélomérique est faiblement méthylé, surexprimant hTERT. Nous avons également vérifié si une reméthylation de l’ADN subtélomérique pouvait avoir lieu dans des cellules cancéreuses TEL+ ayant subi un traitement par agent déméthylant

Telomere --- DNA Methylation

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Leukemia, T-Cell. --- DNA Methylation.

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DNA methylation targets essentially cytosines of CpG dinucleotides.lt is an epigenetic mark involved in transcriptional repression. While DNA methylation profiles are generally well preserved during cellular divisions, they become however strongly deteriorated in tumor cells. Within a single cell, an important loss of methylation {hypo methylation) distributed on ail the genome is observed, as well as a gain of methylation {hyper methylation) at the level of the promoter of certain genes. Even if DNA hypo methylation concerns a majority of tumors, its role in tumor development remains poorly understood.ln this work, we investigated the possibility that DNA hypo methylation in tumors can lead to aberrant activation of microRNAs. Our experiments were principally focused on GABRA3. This gene includes the sequence of two microRNAs and displays characteristics of a gene potentially controlled by DNA methylation. We analyzed the expression of GABRA3 and the two hosted microRNAs {mir- 105 and mir-767) in healthy tissues and in melanomas. Our results demonstrate that expression of this gene and these microRNAs is activated in 80% of melanoma cells lines and tissues, whereas their expression in healthy tissues is limited to germ cells and brain cells. Using 5'RACE, we identified two alternative transcripts of GABRA3 with distinct transcription starts. The first one { BG-GABRA3) is expressed in brain and germ cells, whereas the second one {CG-GABRA3) is only transcribed in germ cells and is activated in tumors. Both are susceptible to generate mir-105 and mir-767.We showed that only the transcription of CG-GABRA3 transcript can be induced by a demethylating agent in cells where it was initially not expressed. Thus, these results show that DNA demethylation is enough to induce expression of this transcript. However, DNA methylation analyses by bisulfite sequencing did not yet allow us to identify the sequence that regulates its expression. Finally, to determine the function of mir-767 and mir-105, we tried to identify their target genes by an in silico approach. This suggested that mir-767 is able to diminish the expression of TET1, TET3 and IDH2. This prediction was partially confirmed by 3'UTR luciferase assays. These three potentials targets are involved in a common metabolic pathway: methyl cytosine hydroxylation.Together, our results demonstrate that DNA hypo methylation in tumors can lead to the activation of microRNAs. Among these, mir-767 could contribute to additional epigenetics alterations in tumors,via inhibition of the methyl cytosine hydroxylation machinery. lndeed,it has been demonstrated that this DNA modification pathway serves to maintain some chromatine regions in an open umethylated state. La méthylation de l'ADN, qui cible majoritairement les cytosines des dinucléotides CpG, est une marque épigénétique impliquée dans la répression transcriptionnelle. Si le profil de méthylation de l'ADN est généralement bien préservé au cours des divisions cellulaires, il est cependant profondément altéré dans les cellules tumorales. Au sein d'une même cellule, on peut ainsi observer une perte importante de la méthylation (hypométhylation) répartie sur tout le génome et un gain de méthylation (hyperméthylation) au niveau du promoteur de certains gènes. Bien que l'hypométhylation de l'ADN concerne la majorité des tumeurs, son rôle dans les cellules tumorales reste majoritairement incompris.Dans ce rapport, nous avons investigué la possibilité que l'hypométhylation de l'ADN dans les tumeurs puisse conduire à l'activation aberrante de microARNs.Nos expériences se sont principalement centrées sur le gène GaBRA3 qui comprend la séquence de deux microARNS et qui possédait les caractéristiques d'un gène potentiellement contrôlé par la méthylation de l'ADN. Nous avons analysé l'expression de GABRA3 etdes microARNs, localisés dans sa séquence, mir-105 et mir-767, au sein des tissus sains et de mélanomes. Par des expériences de 5'RACE, nous avons identifié deux transcrits alternatifs de GABRA3, avec des démarrages de transcription distincts : le premier (BG-GABRA3) est exprimé dans les cellules germinales et cérébrales, est activée dans 80% des lignées et des tissus de mélanomes. Par des expériences de S'RACE, nous avons identifié deux transcrits alternatifs de GABRA3, avec des démarrages de transcription distincts : le premier (BG­ GABRA3) est exprimé dans les cellules cérébrales et germinales, alors que le second (CG-GABRA3) est transcrit uniquement dans les cellules germinales et activé dans les tumeurs. Tous deux sont susceptibles de générer les mir-105 et mir-767. Nous avons montré que seule la transcription du transcrit CG-GABRA3 peut être induite par un agent déméthylant dans des cellules qui ne l'expriment initialement pas. Ces résultats révèlent donc que la déméthylation de l'ADN suffit à induire l'expression de ce transcrit. Toutefois, nos analyses des marques de méthylation par séquençage bisulfite ne nous ont pas encore permis d'identifier la séquence qui régule son expression . Enfin, pour déterminer la fonction de mir-767 et mir-105, nous avons tenté d'identifier leurs gènes cibles par une approche in silice. Les résultats, partiellement confirmés par des expériences de 3'UTR luciferase assay, suggèrent que mir-767 est capable de diminuer l'expression de TET1, TET3 et IDH2, trois gènes impliqués dans la même voie de métabolisation, à savoir l'hydroxylation des méthylcytosines .Ensemble, nos résultats démontrent que l'hypométhylation de l'ADN dans les tumeurs peut conduire à l'activation de microARNs. Parmi ceux-ci, le mir-767 pourrait avoir pour effet d'aggraver les dérèglements épigénétiques dans les tumeurs, via l'inhibition de la machinerie d'hydroxylation des méthylcytosines. Celle-ci a en effet pour rôle de maintenir certaines régions de la chromatine dans un état ouvert, non-méthylé.

DNA Methylation --- Neoplasms --- GABRA3 protein, human