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Le bactériophage 2C, phage lytique de Bacilius subtilis, possède un génome constitué d’une molécule d’ADN linéaire double brin d’une taille de 150.000 paires de bases où la thymine est entièrement remplacée par une base anormale : l’hydroxyméthyluracile.
Ce travail vise à étudier le mode de réplication du génome viral. A cette fin, deux voies différentes ont été utilisées : la caractérisation de mutants thermosensibles permettant de sélectionner les mutants de réplication et l’isolement par clonage d’éléments auto réplicatifs viraux.
Des mutants thermosensibles du virus 2C ont été isolés, puis caractérisés par trois techniques différentes :
une méthode fluorimétrique, la biosynthèse d’ADN en présence d’uridine marquée et la biosynthèse d’ADN dans des cellules perméabilisées.
La spectrofluorimétrie a permis de mesurer in vivo la quantité d’ADN présent dans des cellules infectées, en utilisant deux fluorochromes qui ont un comportement différent vis-à-vis des ADN bactériens et viraux en fonction de la composition en base de ceux-ci et de la présence de la base anormale dans le génome viral. Cette méthode a permis de regrouper les mutants du phage 2C en trois grandes familles d’après les fonctions qui seraient affectées :
- synthèse ou incorporation de la base anormale
- réplication de l’ADN viral
- absence d’inhibition de la synthèse de l’ADN bactérien ou réplication ralentie de l’ADN viral.
Pour quelques mutants caractéristiques de chaque famille ainsi définie, nous avons mesuré la biosynthèse de l’ADN viral en présence d’uridine marqué au tritium, dans une souche déficiente dans le système de réparation de l’ADN (rec E4) de B. subtilis, après perturbation du système réplicatif bactérien par les rayons ultra-violets. Cette méthode regroupe les mutants en deux classes :
1. synthèse normale de l’ADN viral
2. réplication ralentie.
Ces données permettent de supposer que le virus 2C peut utiliser certaines fonctions bactériennes pour assurer la réplication de son génome.
La caractérisation par ultracentrifugation isopycnique et par hybridation de l’ADN synthétisé dans des cellules infectées rendues perméables a permis de confirmer les fonctions affectées pour quelques mutants. L’un de ceux-ci serait affecté dans l’inhibition de la synthèse de l’ADN bactérien, un autre dans la biosynthèse de la base anormale ou dans son incorporation dans l’ADN viral.
En utilisant la technique de clonage, nous avons permis à un plasmide (pCM3) ne se répliquant pas initialement dans B. subtilis, de se répliquer dans cet hôte grâce à l’insertion d’un fragment d’ADN provenant du virus 2C. Ceci laisserait supposer que ‘l’origine de réplication virale peut-être reconnue par le système réplicatif bactérien et que l’initiation de la réplication du génome viral peut se dérouler en absence de la base anormale

Bacteriophages --- Replica Techniques --- Bacillus subtilis --- Cloning, Molecular

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Proteins --- Cells --- Cloning, Molecular --- Gene Expression Regulation

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Genetic engineering --- Gene expression --- Cloning --- Cloning, Molecular --- DNA, Recombinant --- Genetic Intervention --- Cloning. --- Gene expression. --- Genetic engineering. --- Cloning, Molecular. --- DNA, Recombinant. --- Genetic intervention. --- Cloning, molecular. --- Dna, recombinant. --- Molecular cloning.

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Yersinia entercolitica est un agent de gastroenteritis rencontré assez fréquemment chez l’homme. Différents facteurs de virulence ont été identifiés chez cette bactérie. Parmi ceux-ci, certains sont codés par le chromosome : l’entérotoxine Yst, les fimbriae Myf, les internalines Inv et Ail, ainsi que la capacité de capter le fer ; tandis que d’autres sont codés par un plasmide de 70kb, appelé pYVe : la dépendance vis-à-vis des ions Ca[2+], la protéine YadA, les protéines Yops et la lipoprotéine YlpA. L’expression de ces fonctions de virulence est régulée par la protéine de type histone YmoA et/ou par la température et/ou par les ions Ca[2+].
Le fait que les gènes yst et myf soient uniquement transcrits durant la pahse tardive de croissance rendait intéressante l’idée d’étudier le facteur de régulation impliqué dans ce phénomène. Un des candidats potentiel était la protéine RopS, qui est un facteur σ de l’ARN polymérase, déjà décrit chez d’autres entérobactéries. Ce dernier contrôle l’expression de tout un régulon permettant à la bactérie d’acquérir une certaine résistance vis-à-vis de diverses agressions durant la phase stationnaire de croissance.
Ce travail a permis d’identifier un homologue de rpoS chez Y. enterocolitica et de cloner ce dernier à partir du chromosome.
Le gène rpoS de Y. enterocolitica a également été séquencé. Il possède une taille de 993pb et il code une protéine similaire aux autres facteurs σ, particulièrement aux facteurs RpoS identifiés chez d’autres entérobactéries. Les deux gènes entourant rpoS ont été identifiés. Le gène en amont de rpoS est similaire au gène nlpD d’E. coli qui code une lipoprotéine impliquée dans la survie de la bactérie durant la phase stationnaire. Le gène en aval de rpoS est similaire au gène mutS d’E. coli qui code une protéine corrigeant les désappariements au niveau de l’ADN.
Nous avons aussi construit un mutant Y. enterocolitica rpoS par échange allélique afin d’étudier l’influence de RpoS sur l’expression de différents facteurs de virulence. Il s’est avéré que l’expression des deux gènes exprimés durant la phase tardive, yst et myf, était significativement réduite. Ce résultats semble donc suggérer l’intervention du facteur RpoS dans la régulation de l’expression de ces gènes.
Enfin, nous avons tenté de complémenter cette mutation en apportant en trans la protéine RpoS de Y. enterocolitica. Malheureusement, nous n’avons pas réussi à restaurer la production de Yst à un taux identique à celui observé chez la souche sauvage de Y. enterocolitica. La cause de cet échec est discutée plus en détail dans le présent travail.

Yersinia enterocolitica --- Cloning, Molecular --- Sequence Analysis --- Medical Laboratory Science

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To understand why anti-tumoral vaccination leads to tumor regressions in only a minority of patients, we wish to be able to study cytokine gene expression in single T cells from cancer patients.
Therefore, we set up a reliable technique to analyze single cells at the transcriptionnal level. It includes micro-aspiration of individual cells, cDNA synthesis, and quantitative PCR carried out with the genetic material from a single cell, without any preliminary amplification. Setting up this methodology with clonal populations of CD4+ and CD8+ T cells stimulated with PMA-ionomycin, we observed strong intercellular heterogeneity in cytokine gene transcription. Analyzing this heterogeneity, we found out that the main explanation, which cannot be demonstrated rigorously, is differences in the kinetics of activation of individual cells.
We then applied our method to the ex vivo analysis of single blood T cells from patients. We observed an important difference in the proportions of IFNg-producing CD8+ T cells : all anti-EBV CD8+ cells from one donor transcribed the IFNg gene, whereas only 12,5% of anti-MAGE-3.A1 CD8+ cells from a melanoma patient did so. The latter cells are quite rare in blood, and our method is so far the only possibility to analyze them. We will pursue our work by trying to understand the reason for this apparent « anergy » of anti-tumoral T cells Afin de comprendre pourquoi la vaccination anti-tumorale mène à la régression de la tumeur chez une minorité de patients, nous avons voulu étudier les profils d'expression de gènes codant des cytokines dans des lymphocytes T individuels provenant de patients atteints de cancer.
Pour ce faire, nous avons dû mettre au point une technique fiable d'analyse transcriptionnelle de cellules individuelles. Celle-ci comprend l'aspiration des cellules une à une, la synthèse d’ADNc, et les PCR quantitatives réalisées à partir du matériel génétique d'une seule cellule, sans amplification préalable. Lors de ces différentes mises au point, qui ont été réalisées sur des populations clonales de lymphocytes T CD4+ et CD8+ stimulés avec un mélange PMA-ionomycine, nous avons observé une forte diversité intercellulaire au niveau de la transcription des gènes codant des cytokines. Nous l'avons alors étudiée. L'explication majeure de cette diversité, qui ne peut en fait être formellement démontrée, est qu'il existe des cinétiques d'activation différentes d’une cellule à une autre.
Nous avons ensuite, grâce à la même méthode, analysé ex vivo des lymphocytes T individuels provenant de patients et nous avons observé une importante différence dans les profils d'expression d'IFNg parmi les cellules en produisant. Tous les lymphocytes T CD8+ anti-viraux provenant d'un donneur transcrivent le gène codant l’IFNg alors que seulement 12,5% des lymphocytes T CD8+ anti-tumoraux provenant d'un patient atteint de mélanome le font. Ces derniers sont très rares dans le sang de ces patients et notre méthode est pratiquement la seule possibilité pour les analyser. Nous souhaitons poursuivre nos recherches afin de comprendre la raison de cette apparente « anergie » des lymphocytes T anti-tumoraux

T-Lymphocytes --- melanoma-specific antigens --- T-Lymphocytes, Cytotoxic --- Cloning, Molecular