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Le bactériophage 2C, phage lytique de Bacilius subtilis, possède un génome constitué d’une molécule d’ADN linéaire double brin d’une taille de 150.000 paires de bases où la thymine est entièrement remplacée par une base anormale : l’hydroxyméthyluracile.
Ce travail vise à étudier le mode de réplication du génome viral. A cette fin, deux voies différentes ont été utilisées : la caractérisation de mutants thermosensibles permettant de sélectionner les mutants de réplication et l’isolement par clonage d’éléments auto réplicatifs viraux.
Des mutants thermosensibles du virus 2C ont été isolés, puis caractérisés par trois techniques différentes :
une méthode fluorimétrique, la biosynthèse d’ADN en présence d’uridine marquée et la biosynthèse d’ADN dans des cellules perméabilisées.
La spectrofluorimétrie a permis de mesurer in vivo la quantité d’ADN présent dans des cellules infectées, en utilisant deux fluorochromes qui ont un comportement différent vis-à-vis des ADN bactériens et viraux en fonction de la composition en base de ceux-ci et de la présence de la base anormale dans le génome viral. Cette méthode a permis de regrouper les mutants du phage 2C en trois grandes familles d’après les fonctions qui seraient affectées :
- synthèse ou incorporation de la base anormale
- réplication de l’ADN viral
- absence d’inhibition de la synthèse de l’ADN bactérien ou réplication ralentie de l’ADN viral.
Pour quelques mutants caractéristiques de chaque famille ainsi définie, nous avons mesuré la biosynthèse de l’ADN viral en présence d’uridine marqué au tritium, dans une souche déficiente dans le système de réparation de l’ADN (rec E4) de B. subtilis, après perturbation du système réplicatif bactérien par les rayons ultra-violets. Cette méthode regroupe les mutants en deux classes :
1. synthèse normale de l’ADN viral
2. réplication ralentie.
Ces données permettent de supposer que le virus 2C peut utiliser certaines fonctions bactériennes pour assurer la réplication de son génome.
La caractérisation par ultracentrifugation isopycnique et par hybridation de l’ADN synthétisé dans des cellules infectées rendues perméables a permis de confirmer les fonctions affectées pour quelques mutants. L’un de ceux-ci serait affecté dans l’inhibition de la synthèse de l’ADN bactérien, un autre dans la biosynthèse de la base anormale ou dans son incorporation dans l’ADN viral.
En utilisant la technique de clonage, nous avons permis à un plasmide (pCM3) ne se répliquant pas initialement dans B. subtilis, de se répliquer dans cet hôte grâce à l’insertion d’un fragment d’ADN provenant du virus 2C. Ceci laisserait supposer que ‘l’origine de réplication virale peut-être reconnue par le système réplicatif bactérien et que l’initiation de la réplication du génome viral peut se dérouler en absence de la base anormale

Bacteriophages --- Replica Techniques --- Bacillus subtilis --- Cloning, Molecular

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Cloning, Molecular --- Hormones --- Peptide Biosynthesis --- biosynthesis

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Certaines tumeurs expriment des antigènes par des CTLs isolés à partir des lymphocytes des patients. Ces antigènes, tout comme les antigènes d’histocompatibilité mineurs et les antigènes tum-de souris, n’induisent pas de réponse à anticorps. C’est entre autres le cas du mélanome du patient MZ2, pour lequel on a pu définir l’expression de six antigènes spécifiques à l’aide de clones CTL autologues. Nous avons décidé de cloner le gène qui permet l’expression d’un de ces antigènes, l’antigène E.
Comme première étape du clonage, nous avons cotransfecté l’ADN génomique d’une cellule exprimant l’antigène E avec le plasmide sélectionnable pSVtkneoβ, dans une cellule réceptrice qui n’exprimait pas l’antigène E. Parmi 700.000 transfectants résistants à la généticine, nous avons ainsi obtenu 1 transfectant qui exprimait l’antigène E. Nous avons distingué ce transfectant du reste des cellules résistantes à l’antibiotique de sélection grâce à sa capacité de stimuler la production de Tumor Necrosis Factor (TNF) par un clone CTL anti-E.
Nous avons ensuite vérifié que l’antigène exprimé provenait bien de l’ADN transfecté. Pour cela, nous avons sélectionné des variants de perte d’antigène, Nous avons observé que ces variants de perte avaient perdu également des séquences capables d’hybrider une sonde contenant le gène néor.
La perte simultanée de l’expression de l’antigène E et de séquence néor montre que les gènes étaient voisins, car une délétion portant sur l’un d’eux a également affecté l’autre. C’est ce que l’on observe dans le cas de gènes cotransfectés, qui s’intègrent probablement ensemble en un endroit du génome.
Le clonage du gène E va nous permettre d’aborder les gènes permettant l’expression d’antigènes de rejet par des tumeurs humaines. Nous espérons mieux connaître leur spécificité, leur relation possible avec le processus de transformation cancéreuse et leur potentiel éventuel pour l’immunothérapie.

T-Lymphocytes, Cytotoxic --- Gene Library --- Cloning, Molecular --- Medical Laboratory Science

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Grâce au réarrangement somatique des gènes présents dans les cellules germinales (VDJ), les mammifères possèdent un répertoire immunitaire extrêmement large. De plus, des mutations somatiques modifient les régions variables des Ig et augmentent ainsi l’affinité, et accessoirement la spécificité, des anticorps. Nous avons abordé l’étude des mutations somatiques in vitro en recourant à deux modèles.
a)Des lymphocytes B naïfs (IgM membranaire positif et densité élevée) ont subi l’aide d’un clone lymphocytaire Th2 (CDC 35) spécifique des Ig de lapin en présence d’anticorps de lapin anti-IgM de souris utilisés sous forme de fragments F(ab) ‘ 2. b). Des lymphocytes B naïfs ont subi l’aide d’u clone lymphocytaire Th2 (MLS 4.2) via l’antigène MLS. Après quelques jours de culture, les lymphocytes B stimulés ont été fusionnées avec une cellule myélomateuse, SP2/O. L’analyse porte sur les exons, amplifiés à partir d’ADNc. Toutefois, pour éviter les difficultés d’interprétations (la détection d’une mutation suppose connue la séquence non mutée, or la moitié des Vh murins sont inconnus), nous avons amplifié les introns flanquant le réarrangement VDJ. Les introns, uniques dans le génome, sont en effet affectés par les mutations somatiques. Toute mutation devrait y être reconnue sans ambiguïté. L’ADN des hybrides a été digéré et les fragments comportant le réarrangement VDJ, ont été sélectionnés par « Southern blot ». Les produits d’amplification par PCR de ces fragments ont été directement séquencés. Aucune mutation n’a été décelée dans les exons Jh (546 pb) ni dans les introns (4285 pb) flanquant un réarrangement VDJ en 3’. Nous concluons que notre modèle d’activation somatique n’a pas produit une fréquence de mutations somatiques décelable, malgré un outil d’analyse performant, et qu’il faut donc élargir ou changer le système de stimulation in vitro.

Cloning, Molecular --- B-Lymphocytes --- T-Lymphocytes --- Medical Laboratory Science

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Nous avons cloné et séquencé le gène codant pour la glycéral-déhyde-phosphate déshydrogénase de Trypanosoma brucei et nous avons effectué le clonage et le séquençage partiel du gène homologue chez Leishmania mexicana.
L’analyse de es gènes et leur comparaison avec leurs homologues glycosomiaux nous ont montré que :
1. les deux enzymes cytosoliques sont très similaires ; cette observation est valable aussi pour les deux glycéral-déhyde-phosphate déshydrogénase glycosomiales (M. Blaauw et P. Michels, résultats non publiés).
2. il y a de nombreuses différence entre les iso enzymes (cytosolique et glycosomiale), ceci est le cas pour T. brucei comme pour L. mexicana.
Les différences peuvent être partiellement expliquée par une localisation et une fonction différente, mais cette explication n’est pas suffisante.
Elles devraient en grande partie être attribuées à une origine évolutive distincte ou au moins à une très longue évolution séparée. L’un des deux gènes a probablement envahi l’ancêtre, mais pout le moment on ne peut pas dire avec certitude lequel est le gène original.
L’étude de la situation chez L. mexicana nous permet de conclure que les deux gènes existaient déjà dans un ancêtre commun qui a vécu il y a 100 millions d’années

Cloning, Molecular --- Trypanosoma brucei brucei --- Leishmania mexicana --- Medical Laboratory Science