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The periplasm of Gram-negative bacteria is an oxidative environment in which most cysteine residues are involved in disulfide bonds. These disulfide bonds are important for the correct folding and structural stability of many secreted proteins, including several virulence factors.Disulfide bond formation is a catalyzed process in vivo. In bacteria, the proteins that catalyze the formation of disulfide bonds belong to the Dsb (disulfide bond) family. The protein that introduces disulfides into proteins newly translocated to the periplasm is DsbA. DsbA possesses a catalytic CXXC motif, which is maintained oxidized in vivo by the membrane protein DsbB. Whereas the Escherichia coli DsbA/ DsbB system has been extensively studied, the oxidative folding pathways a work in order bacteria, including pathogens, are poorly characterized. The objective of my Master thesis was to characterize the disulfide bond formation machinery of caulobacter crescentus, a non-pathogenic bacterium widely used as a model for alpha-proteobacteria. The analysis of the C. crescentus genome revealed the presence of two potential DsbA (CcDsbA1 and CcDsbA2) and of one potential DsbB (CcDsb). Interestingly, CcDsbA1 and CcDsbB are essential for growth. During my thesis, I started by characterizing CcDsbA1 and CcDsbA2 in vitro.Using the purified proteins, I found that they both have an oxidizing redox potential (-125 Mv), similar to that of E. coli. I also reconstituted the pathway involving CcDsbA1 and CcDsbB in vitro and determined the kinetic parameters of the reaction. Using CcDsbA1 specific antibodies, I confirmed that this protein is maintained oxidized in vivo. Altogether, these results indicate that CcDsbA1 functions with CcDsbB in a pathway that forms disulfide bonds. I also discovered that CcDsbA1 is anchored in the inner membrane, probably via a lipid moiety and I prepared a mutant version of this protein that forms stable complexes with its substrates. My work opens the way to the unraveling of the pathway of disulfide bonds formation C. crescentus. Le périplasme des bactéries à Gram négatif est un milieu oxydant dans lequel la plupart des résidus cystéine des protéines sont engagés dans la formation de ponts disulfures. Ces ponts disulfures, qui contribuent à la stabilité des protéines, sont importants pour le repliement correct de nombreux facteurs de virulence. Ce sont les protéines de la famille Dsb (Disulfide bond) qui catalysent la formation des ponts disulfures dans le périplasme bactérien. Les ponts disulfures sont introduits dans les protéines nouvellement sécrétées dans le périplasme par DsbA. DsbA possède un motif catalytique CXXC, qui est maintenu oxydé in vivo par la protéine membranaire DsbB. Alors que le système DsbNDsbB a été largement étudié chez Escherichia coli, les voies de repliement oxydatif à l'œuvre chez les autres bactéries, dont les pathogènes, sont peu caractérisées.L'objectif de mon mémoire était de caractériser les voies de formation des ponts disulfures chez Caulobacter crescentus. C. crescentus, qui n'est pas pathogène pour l'homme, appartient à la famille des alpha-protéobactéries dans laquelle on retrouve également les bactéries pathogènes Rickettsia et Brucet!a. L'analyse du génome de C. crescentus a révélé la présence de deux DsbA (CcDsbAl et CcDsbA2) et d'une DsbB (CcDsbB) potentielles . Au cours de mon mémoire, j'ai tout d'abord caractérisé CcDsbAl et CcDsbA2 in vitro. En utilisant les protéines purifiées, j'ai déterminé qu'elles avaient un potentiel rédox de -125 mV, comparable à celui de la DsbA de E. coti. J'ai également reconstitué in vitro la voie d'oxydation impliquant CcDsbAl et CcDsbB et j'ai déterminé les paramètres cinétiques de la réaction. J'ai aussi confirmé que CcDsbAl est maintenue à l'état oxydé dans le périplasme. L'ensemble de ces résultats indique que CcDsbAl fonctionne avec CcDsbB dans un système qui forme des ponts disulfures. Par ailleurs, j'ai découvert que CcDsbAl est ancrée à la membrane interne, probablement via une partie lipidique, et j'ai préparé une version mutante de cette protéine capable de former des complexes stables avec ses substrats. Mon travail ouvre la voie à des études ultérieures qui permettront une compréhension détaillée des voies de formation des ponts disulfures chez C. crescentus.

Caulobacter crescentus --- Periplasm --- Bacterial Proteins