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Alzheimer’s disease (AD) is described as being the most common cause of dementia among older people. This neurodegenerative illness is characterized by the progressive loss of neurons in the central nervous system in particular at the level of the hippocampus.This neuronal loss which ends up preading to all the cortical areas is responsible, inter alia, for the appearance of serious behavioural problems as well as cognitive disorders.
Histologically, Alzheimer disease is characterized by the presence of senile plaques in the brain. These extracellular lesions contain a core made up mainly of amyloid B peptide (AB). Amyloid B peptide, whose accumulation is at the root of neuronal death, is produced by the cleavage of its precursor: the amyloid precursor protein (APP). APP is a transmembrane protein whose function remains unknown to date. However, several possible functions of APP have been highlighted. Indeed it seems that APP plays an important role in the mechanisms of neuronal plasticity, the regulation of neuronal excitability and cellular adhesion.
In the course of the present work, we have attempted to analyse the physiological functions of APP. To this end, we silenced expression of the gene coding APP in two cells by plasmid ransfection. Initially, we transfected in a stable way a recombinant plasmid mU6pro into cells from hamster ovaries expressing human APP (CHO APP695) thus inducing important morphological modifications. On the other hand, the stable transfection of cell lines of mouse neuroblastoma (N1E 115) with the recombinant mU6pro shows that the partial silencing of the local expression of endogenous mouse APP inhibits the differentiation of N1E 115 cells induced by DMSO. Thus we show that the inhibition of the expression of APP protein alters neuronal plasticity and cellular adhesion both in neuronal and non-neuronal cell lines La maladie d’Alzheimer (MA) est décrite comme étant la première cause de démence chez le sujet âgé. Cette maladie neurodégénérative se caractérise par la perte progressive des neurones du système nerveux central notamment au niveau de l’hippocampe. Cette perte neuronale qui finit par s’étendre à l’ensemble des aires corticales est responsable, entre autres, de l’apparition d’importants troubles du comportement ainsi que des troubles cognitifs.
Histologiquement, la maladie d’Alzheimer se caractérise par la présence dans le cerveau de plaques séniles. Ces lésions extracellulaires contiennent un noyau constitué majoritairement de peptides amyloïde AB. Le peptide amyloïde AB, dont l’accumulation est à l’origine de la mort des cellules neuronale, est produit par le clivage de son précurseur : le précurseur du peptide amyloïde (APP). L’APP est une protéine transmembranaire dont la fonction reste à ce jour inconnue. Cependant, plusieurs fonctions possibles de l’APP ont été mises en évidence. En effet, l’APP jouerait un rôle important dans les mécanismes de plasticité neuronale, de régulation de l’excitabilité neuronale et d’adhésion cellulaire.
Au cours de ce travail, nous avons tenté d’analyser les fonctions physiologiques de l’APP. Pour cela, nous avons éteint l’expression du gène codant l’APP dans deux modèles cellulaires par la technique d’ARN interférent (RNAi). Les ARN interférents ont été exprimés dans les cellules par transfection de plasmide. Dans un premier temps, nous avons transfecté de manière stable un plasmide mU6pro recombinant dans des cellules d’ovaire d’hamster exprimant l’APP humain (CHO APP695) ce qui induit d’importantes modifications morphologiques. D’autre part, la transfection stables des lignées de neuroblastes de souris (N E 115) avec le mU6pro recombinant montre que l’extinction partielle de l’expression de l’APP endogène de souris inhibe la différenciation de l’expression de la protéine APP altère la plasticité neuronale et l’adhésion cellulaire à la fois dans des lignées de cellules neuronales et non-neuronales

CHO Cells --- Neuroblastoma

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The deposition of amyloid-beta peptides (Aβ) in the brain is an invariable feature of Alzheimer’s disease (AD). The amyloid peptide results from the cleavage of its precursor, the amyloid precursor protein (APP), by the β-and γ-secretase activity. The amyloid peptide plays a major role in the pathologic processus of the disease. Therefore, it seems to be important to understand the mechanism leading to the amyloid peptide production. One of the post-translational modification, the phosphorylation on Thr668, seems to be able to modulate the Aβ production. The kinase involved would be the GSK3.
In our work, we studied the influence of the inhibition of the GSK3 by LiCl on the amyloidogenic and non amyloidogenic metabolism of APP. We analysed the influence of the LiCl in two distinct cells lines. First, we studied the APP metabolism in Chinese Ovary Cells (CHO) expressing human APP695. after, we characterize its metabolism in primary neuronal cultures, which express he human APP695 by infection with recombinant adenovirus. When the GSK3β is inhibited, we chow a significative induction of Aβ production and an accumulation of the APP β-cleaved fragment (CTFβ). Following inhibition of GSK3, there is no phosphorylation modification on Thr668 in CHO while we observe a decrease in this phosphorylation in the neurons.
All together, ours results show an induction of the amyloidogenic pathway in the presence of LiCl which seems to be independent of the phosphorylation of Thr668 of APP. However, our results are in contradiction with studies which observed a decreased of Aβ production when the GSK3 was inhibited. This results underline the importance of a comprehension of the mechanisms which lead to the production of Aβ. Les plaques séniles sont une des deux lésions caractéristiques de la maladie d’Alzheimer. Elles contiennent un noyau de peptide amyloïde Aβ. Ce peptide Aβ est généré à partir d’un précurseur plus grand, l’APP, suite au clivage de deux sécrétases : la β et la γ-sécrétase. >BR> On sait aujourd’hui que le peptide Aβ joue un rôle important dans le processus pathologique de la maladie. Ceci revêt l’importance d’une compréhension précise des mécanismes qui en régulent la production. Un des mécanismes proposé comme intervenant dans la production d’Aβ n’est autre qu’une des modifications post-traductionnelles de l’APP : la phosphorylation. En effet, des études récentes ont montré que la phosphorylation en position thréonine 668 de l’APP695 jouerait un rôle dans la production de peptide Aβ. La kinase potentielle impliquée serait la GSK-3.
Dans ce travail, nous avons donc étudié l’implication de la GSK-3β dans le métabolisme amyloïdogène et non amyloïdogène de l’APP. Nous avons utilisé un inhibiteur spécifique de son activité : le chlorure de lithium (LiCl), utilisé dans le traitement de la maniaco-dépression. Nous avons, dans un premier temps, utilisé des cellules d’ovaires d’hamster chinois (CHO) exprimant le gène de l’APP humain. Nous avosn enusite caractérisé les effets d’un traitement au LiCl dans des neurones embryonnaires de rat exprimant l’APP695 à l’aide d’adénovirus recombinants. Nos résultats montrent, que dans des conditions où l’activité GSK-3β est inhibée, on observe une augmentation significative de la production d’Aβ, accompagnée d’une accumulation des fragments C-terminaux β-clivés de l’APP (CTBβ). Dans ces mêmes conditions, nous n’avons observé aucune modification de l’état de phosphorylation de l’APP695 dans les CHO ; néanmoins, une diminution de la phosphorylation de l’APP est apparue dans la modèle neuronal après traitement au LiCl.
L’ensemble de ces résultats montrent une participation de la GSK-3β dans le métabolisme de l’APP. Cependant, ces résultats vont à l’encontre de certaines études publiées qui observent une diminution de la production d’Aβ en présence de LiCl. Ceci souligne l’intérêt primordial d’une compréhension claire des mécanismes qui sous-entendant la production de peptide Aβ

glycogen synthase kinase 3 beta --- Amyloid --- CHO Cells --- Alzheimer Disease

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Alzheimer’s disease is a neurodegenerative dementia characterized by the coexistence of two typical cerebral lesions : neurofibrillary tangles and senile plaques. The neurofibrillary tangles are composed of paired helical filaments containing the hyperphosphorylated Tau protein, a microtubule-associated protein. Senile plaques are extracellular lesions. They are mainly composed by β-amyloid peptide or Aβ, a 39-43 aminoacids peptide. Aβ is produced by the cleavage of a transmembrane precursor, the Amyloid Precursor Protein (APP).
Here we show that the amount of Aβ measured in the culture medium of CHO cells expressing human APP695 wad thirty times higher than the amount measured in the culture medium of neurons expressing the same amount of human APP695. Kinetic investigations have shown that Aβ accumulates in CHO media and reaches a plateau after 24h. In neuronal media, Aβ accumulates during the first 24h, before decreasing and returning to an undetectable level after 48h.
This could be explained by an Aβ synthesis failure or Aβ degradation in neurons. Our results have shown that Aβ doesn’t stop. Degradation assay of synthetic Aβ have proved that there was indeed Aβ degradation in neuronal media but not in CHO media.
The second part of the work was dedicated to the identification of the protease responsible of this neuronal Aβ degradation. We measured the effect of various protease inhibitors and performed synthetic Aβ degradation assays. The candidate protease was a soluble metalloprotease and it turned out that Insulin Degrading Enzyme (IDE) was the better candidate.
IDE was present in neuronal media and there was little Aβ degradation after IDE immunodepletion of these media. Nevertheless, IDE was also present in CHO media but in an inactive form. We showed that CHO media contained a factor inhibiting Aβ degradation.
Together, our results suggest that IDE mediates Aβ degradation in neuronal media and that IDE present in CHO medium is inactivated by an unidentified inhibitor released in the culture medium of CHO cells. La maladie d’Alzheimer est une démence dégénérative caractérisée par la coexistence dans le cerveau de deux types de lésions : les dégénérescences neurofibrillaires et les plaques séniles. Les dégénérescences neurofibrillaires sont formées de paires hélicoïdales de filaments, dont le constituant majeur est la protéine Tau hyperphosphorylée, une protéine associée aux microtubules. Les plaques séniles sont des lésions extracellulaires qui apparaissent de façon progressives dans le cortex cérébral. Leur constituant principal est le peptide bêta amyloïde ou Aβ, un peptide de 4kDa, constitué de 39 à 43 acides amines. Ce peptide est produit par le clivage protéolytique d’un précurseur transmembranaire : le précurseur du peptide amyloïde (APP).
Nous avons mis en évidence que la quantité de peptide Aβ présente dans les milieux de cellules CHO exprimant l’APP humain est 30 fois plus importante que celle observée dans les milieux de neurones corticaux de rats exprimant la même protéine en quantités équivalentes. Des analyses cinétiques montrent que l’Aβ s’accumule dans les milieux de cellules CHO pour atteindre un plateau au bout de 24 heures. Dans les milieux de neurones corticaux, l’Aβ s’accumule pendant les premières 24h, avant de décroître pour atteindre un niveau indétectable à 48h.
Cette différence pouvait s’expliquer par un arrêt de la synthèse d’Aβ, une recapture du peptide Aβ par les neurones ou une augmentation de la dégradation d’Aβ dans les milieux neuronaux. Nos résultats ont montré que la synthèse d’Aβ n’était nullement arrêtée. Des tests de dégradation d’Aβ synthétique menés dans des milieux conditionnés ont prouvé que le peptide était dégradé dans des milieux de neurones en culture, mais pas dans les milieux de cellules CHO.
La seconde partie du travail a été consacré à l’identification de la protéase responsable de la dégradation d’Aβ dans les milieux de neurones. Pour cela, nous avons testé les effets de différents inhibiteurs de protéases et réalisé les tests de dégradation d’Aβ synthétique. La protéase capable de dégrader l’Aβ dans le milieu de neurones en culture. Elle est également présente dans les milieux des cellules CHO, où sa capacité à dégrader l’Aβ est inhibée. L’inhibiteur reste à identifier.

Alzheimer Disease --- Amyloid --- Endothelin-converting enzyme 1 --- Angiotensin Converting Enzyme 2 --- CHO Cells --- Neurons