Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

Het laboratorium voor Tropische Plantenteelt herbergt, onder de verantwoordelijkheid van Bioversity International, de wereld in vitro collectie van banaanvarieteiten (Musa and Ensete spp.). Het doel van de Bioversity International genenbank is om deze enorme biodiversiteit te bewaren op een verantwoorde en veilige manier en om plantmateriaal te verschaffen aan derden. Het bewaren van plantvariëteiten onder in vitro condities gaat gepaard met een intensief beheer, waarbij de diverse individuele planten opgevolgd en onderhouden moeten worden. Het onderhouden en vermenigvuldigen van de planten is technisch, arbeidsintensief en houdt risico's in die eigen zijn aan menselijke handelingen. Daarenboven lopen de planten het risico om tijdens de in vitro condities te muteren (somaclonale variatie). De K.U.Leuven was een van de pioniers om de mogelijkheden te verkennen om plantencellen te bewaren in vloeibare stikstof bij -196°C. Om diverse variëteiten successvol te cryopreserveren dienen de cellen een strenge uitdroging te overleven alvorens te worden ingevroren en moeten ze na ontdooien terug regeneren tot een volledige plant. Bij banaan zijn enkel meristematische cellen omnipotent en bijgevolg zijn meristemen de enige geschikte structuren om in te vriezen. Deze structuren dienen wel de strenge uitdroging te overleven die gepaard gaat met een succesvole cryopreservatie. In de praktijk wordt de tolerantie voor uitdroging bewerkstelligd door een voorbehandeling: de meristemen worden blootgesteld aan hoge suikergehaltes. Desondanks de voorbehandeling heeft meer dan de helft van de Bioversity International collectie lage tot onbestaande slaagkansen voor cryopreservatie. Gezien het belang van het bewaren van onze biodiversiteit is het van cruciaal belang om een inzicht te verwerven in de aanpassingsmechanismen die plaatsvinden tijdens de voorbehandeling en om de variëteitspecifieke reacties te begrijpen. Inzicht in de genen en de studie van genexpressie kan op verscheidene manieren aangepakt worden. Het eerste hoofdstuk van dit manuscipt biedt een beknopt overzicht van de bestaande technologie met de nadruk op 'proteomics' en zijn geassocieerde technieken. Voor onderzoek van de banaaneiwitten is tweedimensionele gelelectroforesis (2DE) en tandem massaspectrometrie (MS/MS) de meest succesvolle aanpak. Banaan is immers zeer gering gekarakteriseerd op genetisch niveau. Inzicht in de genen en de studie van genexpressie kan relatief gemakkelijk gerealiseerd worden door de intacte banaaneiwitten te vergelijken met die van modelorganismen. Eiwitten zijn in vergelijking met nucleïnezuren relatief gezien zeer goed bewaard gebleven tijdens de evolutie. Hoofdstuk II concentreert zich op de specifieke problemen die gepaard gaan met de eiwitextractie van weerspannige plantenweefsels en op 2DE. De staalvoorbereiding is een van de fundamenten en is essentieel voor een goed resultaat. De meeste plantenweefsels vergen extra aandacht en maatregelen voor eiwitextractie. De celwand en de vacuole vertegenwoordigen het grootste deel van de celmassa. Het cytosol vertegenwoordigt slechts 1 tot 2% van het totale celvolume. Bijgevolg hebben plantencellen relatief gezien een laag eiwitgehalte in vergelijking met zoogdier- en bacteriecellen. Banaan is daarenboven een goed voorbeeld van een weerspannige plantensoort aangezien banaan hoge concentraties aan storende stoffen bevat. Banaan bevat uitzonderlijk hoge concentraties van oxiderende enzymes (vb polyphenol oxydase), fenolische componenten (enkelvoudige fenolen, flavonoïden, tannines, lignine), koolhydraten, terpenen, suberine en was. De meeste protocols voor planten introduceren een precipitatiestap om de eiwitten aan te reiken en te scheiden van de storende componenten. Wij hebben verscheidene protocols geoptimaliseerd en vergeleken voor kleine hoeveelheden startmateriaal (tot 50 mg vers gewicht). Twee methodes waren zeer perfomant: TCA/acetone precipitatie and fenolextractie methanol/ammoniumacetaat precipitatie. De fenolextractie is uiterst efficiënt in het verwijderen van de storende stoffen en leidde tot gels van uiterst hoge kwaliteit. Deze fenol methode is succesvol toegepast op andere planten. Hoofdstuk III concentreert zich op de specifieke problemen die gepaard gaan met het identificeren van eiwitten van matig gekarakteriseerde species en bespreekt twee complementaire benaderingen. Eiwitten van matig gekarakteriseerde species kunnen geïdentificeerd worden door ze te vergelijken met de orthologe eiwitten van modelorganismen. In een eerste benadering werden 'peptide mass fingerprints' of peptide vingerafdrukken en peptide sequentie-informatie op een geautomatiseerde manier gecombineerd om de massaspectra van de banaaneiwitten te interpreteren en de eiwitten te identificeren via de theoretische spectra van gekende eiwitten. Maar sommige eiwitten verschillen te veel van hun ortholoog zodat deze aanpak niet succesvol is. In een tweede aanpak kunnen de spectra direct geïnterpreteerd worden zonder afhankelijk te zijn van de databanken van gekende eiwitten (de novo identificatie). Het interpreteren van spectra en het deduceren van de sequentie is echter niet eenvoudig. MALDI TOF/TOF ion spectra bevatten meestal onvolledige ionseries die afkomstig zijn van meerdere iontypes. Pogingen om de de novo identificatie te vergemakkelijken zijn gebaseerd op het vereenvoudigen van het fragmentatiepatroon. Het toevoegen van een sulfongroep aan het N-terminaal gedeelte van de peptides realiseert deze vereenvoudiging. Deze sterke zure N-terminale groep is gedeprotoneerd en neutralizeert de positive lading van de b-type ionen door zijn negatieve lading. Dit resulteert in een eenvoudig spectrum, dat hoofdzakelijk enkel y-type ionen bevat. Deze innovatieve methode waarbij de geëxtraheerde peptides gesulfoneerd worden zonder verdere staalzuivering werd succesvol toegepast op banaan. Deze methode resulteerde in betrouwbare identificaties en slaagde erin om verscheidene isovormen te identificeren. Eens de technische uitdagingen (staalvoorbereiding en identificatie) overwonnen, concentreert hoofdstuk IV zich terug op de biologische vraag, het begrijpen van de mechanismen achter de suiker gemedieerde acclimatisatie. Banaan is een uniek en uitstekend model voor het bestuderen van meristemen dankzij het ontwikkelen van de multi-meristeemtechniek. Dankzij deze techniek is er voldoende materiaal voor handen en werd een meristeem voor het eerst op grote schaal bestudeerd op eiwitniveau. De resultaten wijzen uit dat het behoud van een beschermend intracellulair suikergehalte, de verhoogde expressie van bepaalde genen betrokken in de energiebehoudende glycolyse en het behoud van de celwand kenmerkend zijn voor de suikervoorbehandeling en essentieel voor homeostasis en voor de overleving van de uitdroging. De vergelijking van een droogte-tolerante variëteit (ABB) en een droogte-gevoelige variëteit (AAAh) maakte het mogelijk om verscheidene genotypische eiwitten te onderscheiden en om de droogte-tolerante variëteit te associëren met eiwitten betrokken in het energiemetabolisme (vb. fosfoglyceraat kinase, fosfoglucomutase, UGPase) en eiwitten betrokken in stressadaptatie (vb. OSR40, ASR). Dit bewijst dat proteoomanalyse succesvol is om quantitatieve verschillen te analyseren en om genetische variatie te karakteriseren in een uniek weefsel van een weerspannig gewas. Hoofdstuk 5 gaat dieper in op de problematiek om nog een beter inzicht te krijgen in het aanpassingsproces en om de acclimatisatie te linken aan cryopreservatie-overleving. Een dynamische studie is opgezet in de tijd en de verschillen tussen verscheidene variëteiten worden bekeken met de nadruk op het valideren van de kandidaateiwitten. Hoewel de suikervoorbehandeling en de hoge intracellulaire suikergehaltes noodzakelijk zijn voor een lage sterfte na cryopreservatie, toch veroorzaakt het ook heel wat stress. De suikervoorbehandeling is gecorreleerd met een relatief hoge aanwezigheid van fosfoglyceraat kinase, UGPase en OSR40 en een relatief lage aanwezigheid van SuSy, lectine and chitinase en ASR. We stellen dat een laag sterftecijfer na cryopreservatie bewerkstelligd kan worden door een relatief lage aanwezigheid van SuSy en een relatief hoge aanwezigheid van fosfoglycerate kinase, UGPase en OSR40, ASR en stockage-eiwitten zoals lectines en chitinases. Het screenen van enkele kandidaateiwitten brengt verscheidene eiwitten en specifieke isovormen in verband met het tolerante B-genoom. The Laboratory of Tropical Crop Improvement (K.U.Leuven, Belgium) hosts, under the authority of Bioversity International, the global in vitro collection of banana varieties (Musa and Ensete spp.). The aim of this international gene bank is to conserve all banana and plantain genetic resources safely and to supply the germplasm to any bona fide users. However, in vitro preserved germplasm needs regular sub-culturing, creating opportunities for losses due to contamination and human error. Moreover, an important problem associated with in vitro culture is the occurrence of somaclonal variation. K.U.Leuven was one of the pioneers to explore the possibilities of storing plant material in liquid nitrogen (at -196°C). However, for successful storage at -196°C, cells need to survive first a severe dehydration process prior to freezing and need to regenerate after thawing. In banana, meristems are the most suitable structures to be cryopreserved. Although meristems have the potential to regenerate, they still need to survive the dehydration associated with cryopreservation. In general, dehydration tolerance is achieved by a sucrose mediated osmotic stress acclimation. However, more than half of the collection consists of varieties that have a nonexistent or low cryopreservation survival rate. Hence, there is a need to unravel the mechanisms behind acclimation during the pre-culture of meristems on sucrose and to get insight into the genotype specific diversity. Understanding gene function and gene expression profiling can be approached via several techniques. A concise overview of the existing technologies is given with the emphasis on proteomics and proteomic technologies. Protein separation via two-dimensional gel electrophoresis and protein identification via tandem mass spectrometry (MS/MS) is the most informative approach for a poorly characterized organism like banana. Proteins are relatively well conserved making the identification of non-model gene products by comparison to well known orthologous proteins quite efficient. Intact proteins (separated via 2DE) are essential for a good and reliable identification. Chapter II focuses on the specific problems of protein extraction of extremely recalcitrant plant tissues and on the 2DE separation. Protein sample preparation is a critical step and is absolutely essential for obtaining good results. Most plant tissues are not a ready source for protein extraction and need specific precautions. The cell wall and the vacuole make up the majority of the cell mass, with the cytosol representing only 1 to 2 % of the total cell volume. Subsequently, plant tissues have a relatively low protein content compared to bacterial or animal tissues. Banana is a good representative of a recalcitrant plant species since it contains numerous interfering compounds. Banana contains extremely high levels of oxidative enzymes (polyphenol oxidase), phenolic compounds (simple phenols (dopa), flavonoids, condensed tannins, lignin), carbohydrates, terpenes, suberin, and waxes. The majority of the plant protocols introduce a precipitation step to concentrate the proteins and to separate them from the interfering compounds. A phenol extraction protocol was optimized for small amounts of banana plant tissue (down to 50 mg fresh weight (FW)) and different sample preparation methods were evaluated. TCA/acetone precipitation and phenol extraction methanol/ammonium acetate precipitation (and only these methods) are both useful as standard methods for recalcitrant plant tissue. The optimized phenol extraction was most efficient in removing interfering substances and resulted in the highest quality gels. This method proved also to be useful for other plant species like apple, pear and potato. Chapter III focuses on the specific problems associated with protein identification of a species with a poorly characterized genome and discusses two complementary approaches. Proteins can be identified by comparing the proteins of interest to orthologous proteins of species that are well characterised. In one approach, peptide mass fingerprints (PMF) and peptide sequence information were combined to search and to correlate the un-interpreted spectra with the theoretical product ion spectra from different databases in an automated way. However, some orthologous genes retain a low percentage of identity and the chance of finding significant and conserved peptides decreases and a pmf-MS/MS approach might fail. A method that extracts protein-identifying information directly from spectra without being dependent on existing databases is extremely useful. However, deriving sequences from MS/MS spectra is not straightforward. MALDI TOF/TOF ion spectra contain in general incomplete ion series typically rich in various ion types. Attempts to simplify the de novo identification rely mainly on the simplification of the fragmentation pattern. The addition of a sulfonic acid group to the N-termini of tryptic peptides facilitates de novo peptide sequencing. The strong acidic group at the N-terminus is deprotonated and therefore neutralizes the positive charge of the b-ion by its negative charge. This results in simple spectra displaying mainly y-ions series. In this chapter, an innovative approach in which the extracted tryptic peptides are N-terminal sulfonated without any further sample purification is reported and successfully applied to banana. It was demonstrated that this approach results in a high and reliable identification rate and that it is adequate to identify different isoforms resulting from allelic variations, or from different gene loci. Now that the technical challenges (sample preparation and protein identification)

Musa --- Ensete --- Banque de gènes --- gene banks --- Culture in vitro --- In vitro culture --- Méristème --- Meristems --- Congélation --- Freezing --- Conservation biologique --- Biological preservation --- Régénération in vitro --- In vitro regeneration --- Adaptation --- Osmorégulation --- Osmoregulation --- Protéine végétale --- Plant protein --- Identification --- identification --- Spectrométrie de masse --- Mass spectrometry --- Academic collection --- 577.2 --- 58.032 --- 581.1 --- 634.771 --- Molecular bases of life. Molecular biology --- Water. Humidity. Aridity --- Plant physiology --- Musa species in general --- Theses --- 634.771 Musa species in general --- 581.1 Plant physiology --- 58.032 Water. Humidity. Aridity --- 577.2 Molecular bases of life. Molecular biology --- Osmoregulation. --- identification.