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Le précurseur du peptide amyloïde (APP) occupe une place centrale dans la pathogénèse de la maladie d'Alzheimer (MA) étant donné que son clivage génère le principal constituant des plaques séniles, le peptide amyloïde (Aβ ). Un aspect précoce de la MA est le dysfonctionnement des mitochondries. En effet, des anomalies de la fonction mitochondriale telles que la diminution de l'activité des enzymes de la chaîne respiratoire, des altérations du contrôle de la qualité des mitochondries suite au dysfonctionnement de la mitophagie et la production d'espèces réactives dérivées de l'oxygène (ROS) apparaissent dans le cerveau de patients atteints de la MA. Les mitochondries pourraient avoir un rôle central dans les détériorations énergétiques et les dégâts oxydatifs des neurones. Dans ce contexte, des études ont mis en évidence que l'APP et le peptide A s'accumulaient dans les membranes mitochondriales, induisant des dégâts fonctionnels et structuraux. En considérant le lien établi dans la littérature entre le dysfonctionnement mitochondrial et l'APP dans la MA, nous avons pour objectif d'étudier le rôle physiologique précis de l'APP dans la fonction mitochondriale par l'étude de différents paramètres : la production d'ATP, le potentiel de membrane mitochondriale (ΔΨm) ainsi que les différences morphologiques et quantitatives des mitochondries dans des lignées dérivées de fibroblastes embryonnaires de souris (MEFs) et dans des cultures primaires de neurones exprimant ou non l'APP. Des données préliminaires obtenues dans le laboratoire avaient mis en évidence que les MEFs déficientes en APP présentent des altérations mitochondriales. Dans ce même modèle, nos résultats suggèrent que l'aspect et la distribution des mitochondries pourraient être différents comparé à leur contrôle respectif. Ceci pourrait s'expliquer par une perturbation du phénomène de fusion/fission mitochondriale faisant intervenir différents acteurs tels qu'OPA1 et MFN2, régulateur de la fission et DRP1, régulateur de la fusion. Dans ces cellules, nous avons observé une diminution du ΔΨm sans changement de la concentration d'ATP. La réexpression de l'isoforme 751 de l'APP dans les MEFs APPKO tend a restaurer partiellement ou complètement certains paramètres tels que la respiration basale, la respiration mitochondriale, la consommation d'02 dédié à la production d'ATP, la capacité de réserve et le potentiel de membrane mitochondriale.Toutefois, dans les neurones, l'aspect et la distribution des mitochondries ne semblent pas être modifiés en absence d'APP. Cependant, l'expression de DRPl semble diminuée dans les neurones APP KO. Nous avons également observés une diminution de la concentration d'ATP sans diminution du ΔΨm dans ces cellules. D'autre part, dans les neurones, la technologie Seahorse ne met pas en évidence un déficit de respiration mitochondrial en l'absence d'APP. Au contraire, les résultats obtenus montrent une tendance à l'augmentation des différents paramètres associés à la respiration mitochondriale dans les neurones n'exprimant pas l'APP.Les premiers résultats obtenus dans le cadre de ce projet donnent certaines indications sur le rôle possible de l'APP dans la fonction mitochondriale. The amyloid precursor protein (APP) constitutes a central part of the pathogenesis of Alzheimer disease (AD) considering its cleavage generates the main constituent of the senile plaques, the amyloid beta peptide (Aβ). An early sign of AD is the mitochondrial dysfunction. Abnormalities of the mitochondrial function such as impairment of oxidative phosphorylation and elevation of reactive oxygen species production appear in the brain of AD patients. Mitochondria are considered to play a critical role in oxidative stress and impaired energy metabolism in neurons. ln this context, studies have shown that APP and A peptide accumulation into the mitochondrial membrane leads to functional and structural impairments. Considering the link that has been established in the literature between the mitochondrial disruption and the APP in the AD, we aimed at studying the physiological role of APP in mitochondrial function. We used WT and APPKO cells lines to measure different markers reflecting mitochondrial activity: ATP production, mitochondrial membrane potential (ΔΨm), mitochondrial morphology related to the expression of fusion/fission proteins, and mitochondrial parameters reflected by oxygen consumption. Similar experiments were carried out in primary culture of neurons from WT and APPKO mice.Data obtained indicated that MEFs deficient in APP display overall mitochondrial deficits. More precisely, our results suggest that the appearance and the distribution of mitochondria could be different in MEFs deficient in APP which could be explained by a defect in mitochondrial fission/fusion. ln APPKO cell lines, we observed a decrease in the ΔΨm and but not in the concentration of ATP. The re-expression of APP isoform751 in MEFs APPKO tends to partially or totally rescue some mitochondrial parameters such as basal respiration, mitochondrial respiration, spare capacity, the ΔΨm and consumption of 02 associated to ATP production. ln neurons, the Seahorse technology does not reveal any mitochondrial deficit. On the contrary, data obtained indicate a rising trend in the different parameters associated to the mitochondrial respiration in neurons deficient in APP. Moreover, mitochondrial appearance and distribution did not seem to be modified in absence of APP. However, we observed a decrease in the production of ATP without modification of the ΔΨm in APP-deficient cells. The results obtained suggest that APP is involved in mitochondrial and cell bioenergetics function by mechanisms awaiting further investigation.

Amyloid beta-Protein Precursor --- Mitochondria --- Alzheimer Disease

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Alzheimer disease is the most frequent neurodegenerative disease, which is characterized by the extracellular accumulation in the brain of the amyloid peptide Aβ. Aβ peptide is produced by two distinct cleavages of its precursor APP. Currently, the function of APP is not known, although the cellular metabolism of the protein was characterized in detail. APP undergoes an intramembrane cleavage by a γ-secretase activity also able to cleave the Notch protein. This cleavage releases the intracellular domain of Notch (Notch Intra Cellular Domain NICD) which is a transcription factor. The cleavage of APP by γ-secretase releases the AICD fragment which, by analogy with the NICD, could control gene transcription. The identification of several genes whose transcription would be controlled by APP could not be confirmed. Therefore, the role of APP in regulation of gene transcription remains questionable.
The aim of this work was to identify genes whose transcription would be controlled by APP and to study the mechanisms involved in this regulation.
The comparative analysis of the transcriptomes from embryonic fibroblasts (MEFs) cultured from wild-type mouse (APP+/+) or APP knocked-out mouse (APP-/-) made it possible to identify several genes whose expression was modified in an important way by the expression of APP. Among these genes, we focused on that coding CXCL5, a pro-inflammatory chemokine which could be involved in neuro inflammation, and whose receptor, CXCR2, is present on neurons. The expression of CXCL5 mRNA (quantitative RT-PCR) and protein (ELISA) was controlled by the presence of the APP in MEFs. The promoter of the CXCL5 gene was cloned upstream the luciferase reporter gene. The weak transcriptional activity of this promoter was similar in APP +/+ and APP-/- MEFs. The stability of the CXCL5 mRNA, measured in the presence of actinomycine D, was also identical in the two cell types. In APP +/+ MEFs, transcription of the CXCL5 gene was inhibited by trichostatin A, a specific inhibitor of the type I and type II histone deacetylases (HDACs). The transcription of the CXCL5 gene was also very sensitive to methylation. These results suggest an implication of APP in the epigenetic control of the expression of CXCL5. This APP-mediated control of CXCL5 expression was also observed in primary cultures of astrocytes, as well as in vivo, in transgenic mice La maladie d’Alzheimer est la maladie neurodégénérative la plus fréquente. Elle est caractérisée, entre autre, par l’accumulation extracellulaire du peptide amyloïde Aβ dans le cerveau. Le peptide Aβ est produit par deux clivages distincts de son précurseur, le précurseur du peptide amyloïde (APP).
Actuellement, la fonction de l’APP n’est pas connue, bien que le métabolisme cellulaire de la protéine ait été caractérisé en détail. L’APP subit un clivage intramembranaire par une activité γ-sécrétase capable également de cliver la protéine Notch. Ce clivage libère le domaine intracellulaire de Notch (Notch Intra Cellular Domain NICD) qui est un facteur de transcription. Le clivage de l’APP par la γ-sécrétase libère le fragment AICD qui, par analogie avec le NICD, pourrait réguler la transcription. L’identification de certains gènes dont la transcription serait régulée par l’APP n’a pu être confirmée, et cette hypothèse reste donc très controversée.
Le but de ce mémoire était d’identifier des gènes dont la transcription serait régulée par l’APP et d’étudier les mécanismes impliqués dans cette régulation.
L’analyse comparative des transcriptomes de fibroblastes embryonnaires (MEFs) provenant de souris wild-type (APP+/+) et APP knock-out (APP-/-) a permis d’identifier certains gènes dont l’expression est modifiée de manière importante par l’expression d’APP. Parmi ces gènes, celui codant CXCL5 a retenu notre attention. CXCL5 est une chémokine pro-inflammatoire qui pourrait intervenir dans des phénomènes de neuro-inflammation et dont le récepteur, CXCR2, est présent sur les neurones. L’expression du mRNA (RT-PCR quantitative) et de la protéine (ELISA) CXCL5 est contrôlée par la présence de l’APP dans les MEFs. Le promoteur du gène CXCL5 a été cloné en amont d’un gène rapporteur luciférase. L’activité transcriptionnelle faible de ce promoteur est semblable dans des cellules MEFs APP +/+ et APP-/-. La stabilité du mRNA de CXCL5, mesurée en présence d’actinomycine D, est également identique dans les deux types cellulaires. Dans des cellules APP +/+, la transcription du gène de CXCL5 est influencée par la trichostatine A, un inhibiteur spécifique des histones déacétylases (HDACs) de type I et de type II. La transcription du gène CXCL5 est également très sensible à la méthylation. Ces résultats suggèrent une implication de l’APP dans le contrôle épigénétique de l’expression de CXCL5. Ce contrôle de l’expression de CXCL5 par l’APP a pu également être observé dans des astrocytes en culture primaire et in vivo, dans des souris transgéniques

Alzheimer Disease --- Amyloid beta-Protein Precursor --- Chemokine CXCL5

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La maladie d’Alzheimer est une démence dégénérative caractérisée par deux lésions neuropathologiques, les dégénérescences neurofibrillaires et les plaques séniles. Le constituant majeur des dépôts amyloïdes des plaques séniles est un peptide appelé βA4. Il dérive d’un précurseur transmembranaire appelé APP (Amyloid Peptide Precursor). L’étude du métabolisme de l’APP est importante pour comprendre la formation des dépôts amyloïdes de la maladie d’Alzheimer. Dans des modèles cellulaires, deux voies cataboliques de l’APP ont été mises en évidence : la voie non amyloïdogène dans laquelle de l’APP soluble est produit par clivage de la protéine au sein même du peptide βA4, et la voie amyloïdogène donnant naissance au peptide amyloïde.
Des cellules CHO ont été cotransfectées par le plasmide pSVK3 comprenant l’ADNc de l’APP 695 et le plasmide pSV2néo, qui contient un gène de résistance à la néomycine. Un des clones obtenu après sélection au G418, produit dans son milieu de culture, l’APP soluble et du peptide βA4 reconnus par des anticorps spécifiques en immun précipitation.
Dans le but d’étudier le rôle de l’internalisation de l’APP transmembranaire dans la formation du peptide βA4, deux méthodes ont été utilisées pour inhiber l’endocytose dans des puits tapissés de clathirine. D’une part, les cellules transfectées ont été cultivées en absence de K+, ce qui provoque des perturbations au niveau de l’assemblage de la clathirine, empêchant l’internalisation des protéines par endocytose. Dans ces conditions expérimentales, l’internalisation de la transferrine, liée à son récepteur, est fortement diminuée. La privation de k+, si elle ne dépasse pas une heure, n’est pas novice pour les cellules, dont la viabilité a été mesurée par le test MTT. Dans le milieu de culture des cellules marquées à a la S-méthionine, puis privées de K+ pendant une heure, l’APP soluble est immunoprécipité. Par contre, le peptide βA4 n’est pas détecté dans ce milieu de culture.
D’autre part, des cellules CHO ont été co-transfectés de manière stable avec le plasmide pSVnéo et le plasmide pSVK3 comprenant l’ADNc de l’APP 695, délété de la séquence codant le domaine C-terminal intracellulaire. Cette délétion a pour conséquence d’éliminer la séquence en acides aminés NPTY, qui joue probablement un rôle dans l’internalisation de l’APP par endocytose dans des puits tapissés de clathrine. Un clone a été sélectionné au G418. Dans le milieu de culture alors que l’APP soluble est produit en quantité supérieure à ce que produisaient les cellules transfectées par l’ADNc de l’APP 695 complet.
Ces résultats montrent que l’inhibition de l’internalisation empêche la formation de peptide βA4. L’endocytose de l’APP transmembranaire dans des puits tapissés de clathrine est donc impliquée dans la production du peptide amyloïde de la maladie d’Alzheimer.

Alzheimer Disease --- Amyloid beta-Protein Precursor --- CHO Cells

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This special topic issue of 'Neurodegenerative Diseases' contains contributions discussing the subject in-depth. 'Neurodegenerative Diseases' is a well-respected, international peer-reviewed journal in 'Neurobiology'. Special topic issues are included in the subscription.

Alzheimer's disease --- Amyloid beta-protein precursor. --- Molecular aspects.

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Alzheimer's disease (AD) is a progressive neurodegenerative disease characterized by two types of pathological lesions : intraneuronal neurofibrillary tangles, and extraneuronal senile plaques largely composed of amyloid deposits. Although the observed amyloid deposits in AD patients may potentially explain their cognitive deficits, numerous studies indicate that disturbed neuronal activity appears long time before the formation of senile plaques. Recently, the hast laboratory has shown that adenovi ral expression of the neuronal isoform of h u ma n amyloid precursor protein (hAPP) in cultured rat cortical neurons can directly affect the GABAergic neurotransmission by downregulating the expression of KCC2, a neuron-specific potassium-chIoride cotransporter that allows efflux of chloride. ln this work, we show that decreasing endogenous expression levels of APP using a lentivirus coding for a small hairpin RNA against rat APP (APP shRNA) increased KCC2 expression levels in cultured neurons. Moreover, we report that the downregulation of KCC2 by hAPP is independent of hAPP intracellular domain (AICD), hAPP amino-terminal domain or y-secretase activity .Finally; we assessed EGR4 and USF1 expression levels, two major transcriptional regulators of KCC2. We show that expression levels of EGR4 remain unchanged in neurons expressing hAPP, while those of USF1 are downregulated in a similar manner ta KCC2, but only in cortical cells expressing full length hAPP. Taken together, these results suggest that APP plays a key role in regulation of KCC2 expression and therefore influencethe GABAergic neurotransmission. La maladie d'Alzheimer (MA) est une maladie neurodégénérative progressive caractérisée par deux types de lésions pathologiques : les dégénérescences neuro fibrillaires intra neuronales, et les plaques séniles extraneuronales composées principalement de dépôts amyloïdes. Bien que les dépôts amyloïdes observés chez les patients atteints de la MA pourraient potentiellement expliquer leurs déficits cognitifs, de nombreuses études indiquent qu'une perturbation de l'activité neuronale apparait bien avant la formation des plaques séniles. Récemment, le laboratoire d'accueil a mis en évidence qu'une expression adénovirale de l'isoforme humaine du précurseur du peptide amyloïde (hAPP) dans des neurones corticaux de rat en culture affecte directement la neurotransmission GABAergique en diminuant l'expression de KCC2, un cotransporteur potassium-chlorure spécifique aux neurones qui permet l'efflux des ions chlorure. Dans ce travail, nous montrons que la diminution des taux d'APP endogène en utilisant un lentivirus recombinant permettant l'expression d'un petit ARN en épingle à cheveux dirigé contre I'APP de rat (APP shRNA) augmente les niveaux d'expression de KCC2 dans des neurones en culture. De plus, nous rapportons que la diminution de l'expression de KCC2 par l'hAPP est indépendante du domaine intracellulaire de l'hAPP (AICD), du domaine amino-terminal de l'hAPP ou de l'activité y-sécrétase. Finalement, nous avons évalué les niveaux d'expression d'EGR4 et d'USFl, deux régulateurs transcriptionnels majeurs de KCC2. Nous montrons que les niveaux d'expression d'EGR4 restent inchangés dans les neurones exprimant l'hAPP, alors que ceux d'USFl sont diminués de la même manière que KCC2, mais seulement dans des neurones exprimant l'hAPP entier. L'ensemble de ces résultats suggère que I'APP joue un rôle clé dans la régulation de de l'expression de KCC2 et influence la neurotransmission GABAergique.

Alzheimer Disease --- GABA Agents --- Sodium Potassium Chloride Symporter Inhibitors --- Amyloid beta-Protein Precursor