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Presenilin 1 and 2 (PSI and PS2) are two homologs that form the catalytic core of an enzymatic complex called y­ secretase. Each complex, containing either PSI or PS2, can cleave APP (Amyloid Precursor Protein) and produce the -amyloid peptide (A) that forms the senile plaques found in Alzheimer's disease (AD) brains. Besides APP, several trans-membrane proteins, including Notch, are known to be y-secretase substrates. Notch has an important role in cell-to-cell communication, thus controlling cell proliferation, differentiation and even cell death. The aim of our project is first to analyze the relative implication of both PS in the proteolytic cleavage of APP and Notch. In a second step, our goal is to study the effect of familial AD and catalytically inactivating PS mutations (respectively AT and DA mutations) on those two processes. To do so, different types of mouse embryonic fibroblasts (MEFs) are used. The cleavages are studied in control cell types expressing both PS, but also in cells which are knockout (KO) for both of them (PS double-KO) or one of them (PSI KO and PS2 KO). We also use cells in which a specific PS is stably re-expressed (non mutated/mutated PSI/PS2) in a null PS background. In order to further characterize the relative implication of the two PS in APP and Notch cleavages we use two known inhibitors of y-secretase activity.In order to quantify APP and Notch cleavages, the different cell types are co-transfected with a C99-GVP construct (expressing the C99 intermediate metabolite of APP catabolism harboring a Gal4-VP16 fusion protein), or with a NotchL1E-GVP construct (expressing the NotchL1E intermediate metabolite of Notch catabolism harboring the same Gal4-VP16 fusion protein), and with two reporter genes expressing either Firejly or Reni/la luciferases. The first vector is a reporter gene directly reflecting the cleavage of the APP and Notch constructs by the y-secretase via the binding of the Gal4 domain to responsive elements Gal4RE upstream the Firejly luciferase sequence. The Reni/la luciferase is expressed under the control of a strong promoter, in order to normalize the transfection efficiency between the different cell types. The expression of the APP/Notch constructs in the cells is verified by immunocytochernistry or by Western blotting. The reporter gene trans-activation is measured with the "Dual­ Luciferase® Reporter Assay System". This setup allows a sensitive and an efficient analysis of APP and Notch constructs cleavages in a standardized system.The results obtained in the KO models show that the endogenous PS 1 is more involved in the y-secretase activity than its PS2 homolog. Results from the rescue models, expressing human PS, suggest that the human PSI is also predominant in the y-secrtase activity, and is more sensitive to the tested mutations than its PS2 homolog. Quite strikingly, the results obtained from the catalytically inactive PS and from pharmacological treatments suggest that PS2 may have a role in APP construct cleavage independently of its enzymatic activity, whereas PS1-dependent cleavage requires a native catalytic site. La famille des présénilines (PS) comprend 2 homologues, PS 1 et PS2, qui forment le cœur catalytique du complexe y-sécrétase. Chaque complexe contient PS1 ou PS2 et est capable de cliver l'APP (Amyloid Precursor Protein) pour produire le peptide -amyloïde (A), que l'on retrouve agrégé dans les plaques séniles, une lésion caractéristique de la maladie d'Alzheimer (MA). Outre l'APP, plusieurs protéines membranaires sont substrats de la y-sécrétase , dont le récepteur Notch. Celui-ci joue un rôle important dans la communication entre cellules, dictant leur prolifération, leur différenciation, ou même leur mort.L'objectif de notre projet est d'abord d'analyser l'implication respective des PS dans le clivage des protéines APP et Notch. Par la suite, le but est d'étudier l'effet de mutations des PS responsables de formes héréditaires de la MA (mutations notées AT), et de mutations inactivant le domaine catalytique des PS (notées DA), sur le clivage de leurs substrats. Pour ce faire, différents types de fibroblastes embryonnaires de souris (MEFs) sont utilisés : des cellules à phénotype sauvage (PS wt), mais également des cellules knockout (KO) pour les PS (PS double-KO ou PS dKO) ou pour une seule d'entre elles (PSl KO et PS2 KO). De plus, nous disposons de cellules PS dKO dans lesquelles l'expression de PS I ou PS2 a été restaurée de façon stable (PS double-KO « rescue »), soit sous forme non mutée (wt), soit sous forme mutée (AT ou DA). Enfin, le rôle des y-sécrétases PSI- et PS2-dépendantes dans le clivage de l'APP et de Notch a été évalué en utilisant 2 inhibiteurs pharmacologiques de la y-sécrétase.Pour quantifier les clivages de l'APP et de Notch, les cellules sont co-transfectées avec une construction C99-GVP (formée de C99, catabolite intermédiaire de l'APP, et de la protéine de fusion Gal4-VPI6) ou une construction NotchôE-GVP (formée du catabolite intermédiaire NotcME de Notch fusionné à Gal4-VPI6), et avec 2 gènes rapporteurs luciférase (Firefly et Renilla). Le premier gène rapporteur détecte le clivage des constructions C99-GVP/NotchôE­ GVP par la fixation des domaines Gal4 à des éléments de réponse clonés en amont du gène de la luciférase Firefly. La luciférase Renilla est exprimée sous le contrôle d'un promoteur fort, pour normaliser les différentes efficacités de transfection des cellules. L'expression des constructions C99-GVP/NotcME-GVP dans les cellules est vérifiée par immunocytochimie ou Western blotting et les clivages sont quantifiés par la méthode « Dual-Luciferase® Reporter Assay System », permettant une analyse efficace de ceux-ci au sein d'un système calibré.Les résultats obtenus dans les modèles KO montrent que la PSI endogène des MEFs a une implication préférentielle dans le complexe y-sécrétase par rapport à son homologue PS2. Les résultats issus des modèles « rescue » suggèrent que la PSI humaine est, elle aussi, primordiale dans l'activité y-sécrétase , et est plus affectée par les mutations testées que la PS2. Les observations faites par inhibition de l'activité catalytique des PS (par traitements pharmacologies et par mutations DA) suggèrent que la PS2 peut cliver la construction APP indépendamment d'une activité catalytique, tandis que le clivage réalisé par PSl serait uniquement d'origine catalytique pour les deux substrats étudiés.

Amyloid Precursor Protein Secretases --- Alzheimer Disease

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Alzheimer’s disease (AD) is characterized by the presence of two types of neuropathological lesions in the brain namely intraneuronal fibrillary tangles and senile plaques. The tangles contain the hyperphosphorylated microtubule-associated protein tau while the senile plaques are mainly composed by the Aβ peptide. The Aβ peptide is produced from the metabolism of amyloid precursor protein (APP). Although APP processing has been extensively studied, its function remains unclear.
The failure of the lipid homeostasis plays a central role in developing AD. On the one hand, patients suffering from hypercholesterolemia treated by the statins have a lower risk in developing the disease. On the other hand, in cellular and animals models, cholesterol depletion decreases the Aβ production.
Cellular cholesterol content is controlled by a family of transcription factors known as sterol regulatory element-binding protein (SREBP) which are anchored in the membrane of the endoplasmic reticulum (ER). Upon cellular cholesterol depletion, SREBP leaves the ER to reach the Golgi complex. In this compartment, SREBP is cleaved by the Site-1 and Site-2 Proteases. The Site-2 cleavage releases the mature SREBP (mSREBP). mSREBP translocates into the nucleus and activates genes transcription, such as HMG-CoA reductase gene.
Throughout this study, we focused on the influence of the APP on the cholesterol metabolism. In primary cultures of rat cortical neurons, human APP (hAPP) adenoviral expression decreases cholesterol synthesis and HMG-CoA reductase mRNA. APP, by interacting with SREBP in the Golgi complex, inhibits mSERBP production. We demonstrated that reduction of endogenous neuronal APP expression by shRNA leads to increased production of mSREBP and increased HMG-CoA reductase mRNA level. These data point out a Key role of APP in the control of neuronal cholesterol homeostasis.
Nevertheless, in adult brain, neurons mainly rely on astrocytes for their cholesterol supply. Consequently, we have studied the APP expression impact on cholesterol homeostasis in primary cultures of rat astrocytes. The hAPP expression does not affect cholesterol synthesis and HMG-CoA reductase mRNA level in astrocytes. In line with this, immunocytochemistry assays have revealed that hAPP is not located into the Golgi complex, unlike in neurons.
The lack of control by APP on cholesterol metabolism in astrocytes therefore results from a different subcellular localization of APP compared to neurons La maladie d’Alzheimer est une démence neurodégénératrice caractérisée par la présence dans le cerveau, de deux types de lésions: les dégénérescences neurofibrillaires et les plaques séniles. Les paires hélicoïdales de filaments, retrouvées dans les dégénérescences neurofibrillaires, sont principalement composées de protéines Tau hyperphosphorylées. Les plaques séniles contiennent un noyau amyloïde dont le composant majeur est le peptide Aβ. L’Aβ est produit suite au clivage de l’APP, le précurseur du peptide amyloïde (Amyloïd Precursor Protein). Bien que le métabolisme cellulaire de l’APP ait été largement étudié, sa fonction reste très mal connue.
La rupture de l’homéostasie lipidique joue un rôle important dans le développement de la maladie d’Alzheimer. Des patients souffrant d’hypercholestérolémie traitée par les statines ont un risque réduit de développer la maladie. D’autre part, dans des modèles animaux et cellulaires une déplétion en cholestérol conduit à une diminution de la production d’Aβ. La charge en cholestérol des membranes cellulaires est contrôlée par une famille de facteurs de transcription appelés sterol regulatory element-binding protein (SREBP). Suite à la translocation de SREBP du réticulum endoplasmique vers l’appareil de Golgi, le clivage de SREBP par la protéase S2P libère la forme mature du facteur de transcription (mSREBP). Ce facteur active la transcription de gènes impliqués dans le métabolisme des lipides, dont celui codant l’HMG-CoA réductase.
Au cours de ce mémoire, nous avons étudié l’influence de l’APP sur le métabolisme du cholestérol. Dans des cultures primaires de neurones embryonnaires de rat, l’expression adénovirale d’APP humain (APPh) diminue la synthèse de cholestérol et la transcription du gène codant l’HMG-CoA réductase. L’APP, en interagissant avec SREBP dans l’appareil de Golgi, inhibe le clivage S2P de SREBP et empêche la libération de mSREBP. Nous avons également observé qu’une réduction de l’expression d’APP endogène par un shRNA augmente la production de mSREBP et augmente la transcription de l’HMG-CoA réductase. Ceci démontre que l’APP contrôle la synthèse du cholestérol neuronal. Néanmoins, dans le cerveau adulte, les neurones reposent essentiellement sur l’apport de cholestérol fourni par les astrocytes pour répondre à leur besoin. Nous avons donc étudié l’influence d’une modification de l’expression d’APP sur la synthèse de cholestérol dans des cultures primaires d’astrocytes de rat.
A l’inverse de ce qui a été décrit dans les neurones, l’expression d’APPh ne modifie ni la synthèse de cholestérol, ni la transcription du gène codant l’HMG-CoA réductase, dans les astrocytes. De même, la diminution de l’expression d’APP endogène n’influence pas la transcription du gène codant l’HMG-CoA réductase. Des analyses par immuno-cytochimie ont révélé que, dans les astrocytes, l’APP n’est pas localisé dans l’appareil de Golgi, compartiment dans lequel SREBP-1 est majoritairement présent, contrairement aux neurones.
L’absence de contrôle de l’APP sur le métabolisme du cholestérol dans les astrocytes résulterait donc d’une localisation subcellulaire différente de l’hAPP par rapport aux neurones.

Alzheimer Disease --- Amyloid Precursor Protein Secretases --- Cholesterol --- Sterol Regulatory Element Binding Proteins --- Homeostasis --- Astrocytes