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In this study, we tried to have a further understanding about how AMPK regulates 0- GlcNAcylation. Firstly, we studied the role of 0-GlcNAcylation in the anti-hypertrophic effect of AM PK at high concentration of AMPK activators, known to also regulate protein synthesis and gene transcription. In order to study if AMPK can also reverse hypertrophy in vitro and not only prevent it, we conducted some experiments where hypertrophy was already established before AMPK activation. Moreover, we confirmed the previous results of the laboratory in another in vivo mode!, namely TAC (Transverse Aortic Constriction) and we tried to define how AMPK regulates the three major enzymes of HBP by studying their transcriptional regulation and phosphorylation state. Finally, we started to elaborate an 0-GlcNAcylomic approach to identify the main targets of 0-GlcNAcylation and see which ones show an increase of 0-GlcNAcylation state during cardiac hypertrophy and a decrease following AMPK activation. Cardiac hypertrophy is defined by an increase in heart mass and is initially considered as an adaptive cellular response that tries to maintain cardiac output. However, under prolonged pathological stimuli, cardiac hypertrophy leads to impaired cardiac function and the development of heart failure. A potential target in the prevention of myocardial hypertrophy is the AMP-activated protein kinase (AMPK), a serine/threonine protein kinase acting as a sensor and regulator of cellular energy metabolism. Many studies have already shown that AMPK is a key inhibitor of pathological cardiac hypertrophy due to its ability to inhibit cardiac hypertrophy-related pathways such as protein synthesis (mTOR/P70S6K) and gene transcription (MAPK and NFAT/calcineurin). However, the underlying mechanism is challenged since the recent discoveries from CARD laboratory. Indeed, they showed that low dose of AMPK activator prevents cardiac hypertrophy without affecting the known AMPK targets involved in this pathology. Therefore, they proposed 0-GlcNAcylation, a post­ translational modification dependent on the hexosamines biosynthetic pathway (HBP) to be involved. Indeed, previous studies have shown that protein 0-GlcNAcylation levels are increased in cardiac hypertrophy. Interestingly, the laboratory showed that activation of AMPK is able to inhibit the increase of 0-GlcNAcylation caused by pro-hypertrophic agents such as phenylephrine (PE) in vitro and Angiotensin II (Angll) in vivo. Their hypothesis is that AMPK inhibits 0-GlcNAcylation by regulating the three main enzymes involved in this process, namely fructose-6-phosphate amidotransferase (GFAT), 0-GlcNAc transferase (OGT) and 0- GlcNAcase (OGA).

AMP-Activated Protein Kinases

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In this early 21st century, one of the most problematic pathology is the metabolic syndrome. Development of cardiovascular disorders represents one of the major consequences of this syndrome. Insulin resistance, which is characterized by the loss of metabolic responses to insulin, is one of the events defining the metabolic syndrome. For instance, we observed a decrease in glucose uptake and oxidation which is implicated in the development of diabetic cardiomyopathy. Insulin resistance represent also a major risk of developing other cardiovascular diseases such as cardiac hypertrophy, myocardial infarction, heart failure. A way of resensitizing the cardiac tissue is considered as an interesting therapy in order to reduce the apparition of the conditions and to improve the recovery of function after an eventual ischemic event. The Stimulation of AMP-dependent kinase (AMPK) is able to sensitize the heart to insulin by molecular mechanisms that are not yet totally understood. In opposition to what has commonly be approved in the literature, the host laboratory proved that the inhibition of the insulin negative feedback is not involved in the insulin-sensitizing effect of AMPK on cardiac glucose uptake and proposed that this effect might involved the actin cytoskeleton rearrangement which is under the control of the small G protein Rac.We focused on Rac and showed that Rac can be activated by insulin as well as by phenformin, an AMPK activator. Rac pharmacological inhibition leads to the loss of the implication of the Rac in this effect. We are currently developing some genetic methods such as silencing RNA and overexpression of a dominant negative form of Rac to definitively demonstrate the role of this small G protein. In parallel, we are also developing the HAGLUT4-GFP fusion protein expression in adult rat cardiomyocytes. This tool will help up studying the AMPK and the small G protein Rac in the translocation, docking and fusion of GLUT4 with the plasma membrane. Le syndrome métabolique est une des pathologies les plus préoccupantes en ce début de 21ème siècle. Une des conséquences majeures de ce syndrome est l'apparition de troubles cardiovasculaires. Il se définit par plusieurs phénomènes dont l'insulino-résistance cardiaque qui se caractérise par une perte de réponse métabolique à l'insuline. On observe, par exemple, une diminution du captage et de l'oxydation du glucose impliquée dans l'apparition de cardiomyopathies diabétiques. Cette résistance présente également un risque majeur de développer d'autres maladies cardiovasculaires telles que l'hypertrophie, l'infarctus et l'insuffisance cardiaque.Une resensibilisation du tissus cardiaque à l'insuline permettrait de diminuer l'apparition de ces maladies et d'améliorer la récupération de fonction après un épisode ischémique éventuel. La stimulation de I'AMP-activated protein kinase (AMPK) sensibilise le cœur à l'insuline par des mécanismes moléculaires encore partiellement incompris. L'indentification de ces mécanismes a fait l'objet de ce travail. Contrairement à ce qui a été récemment proposé dans le muscle squelettique, nous avons montré que la diminution du cholestérol membranaire induite par l'activation de I'AMPK ne permet pas d'expliquer l'effet insulino-sensibilisateur de cette dernière sur le transport de glucose cardiomyocytaire. Nous nous sommes par la suite intéressés à la petite protéine G Rac.En effet, le laboratoire d'accueil ava it précédemment montré que la réorganisation du cytosquelette d'actine, connue pour être sous le contrôle de Rac,sembla it impliquée dans l'effet insulino-sensibilisateur de I'AMPK.Nous avons montré que Rac est activée à la fois par l'insuline et par la phenformine, un activateur de I'AMPK. En outre, nous avons montré que l'inhibition pharmacologique de Rac, par deux molécules différentes,entraine une perte de l'effet insulino-sensibilisateur de I'AMPK sur le transport de glucose myocardique. Des modèles génétiques,tels que la diminution de l'expression de Rac par ARN interférent et la surexpression d'une forme dominante négative de Rac, ont également été mis au point afin de pouvoir démontrer dans un futur proche le rôle de cette protéine G dans les phénomènes qui nous intéressent . En parallèle, nous avons mis au point l'expression d'une protéine chimérique HA-GLUT4-GFP dans le cardiomyocyte de rat adulte. Cet outil nous permettra d'étudier la translocation, l'ancrage et la fusion de la protéine GLUT4 avec la membrane plasmique. Nous pourrons ainsi étudier l'implication de I'AMPK et de la petite protéine G Rac dans ces trois mouvements de GLUT4.

Metabolic Syndrome X --- AMP-Activated Protein Kinases

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Oxidative stress exists when there is an imbalance between oxidants, such as reactive oxygen species (ROS), and antioxidant defenses in favor of the oxidants in the cell. AMP-activated protein kinase (AMPK) has emerged in recent years as a kinase that controls the redox-state, but its mechanisms of action remain to be elucidated. By other way, CYP2El , a cytochrome P450 who contributes to detoxify drugs, is a well-known ROS producer, present in the liver. Thus, we investigated whether AMPK activation was associated with changes in cell viability, redox status and whether CYP2El was involved in these observations . The study was realized with two lines derived from human hepatocellular carcinoma HepG2 cells transfected with an expression vector containing gene coding for CYP2E l for E47 and with an empty vector for C34. AICAR (5-aminoimidazole-4-carboxamide-1- -D-ribofuranoside) is used as AMPK activator. AICAR activates AMPK in E47 and C34 cells in a time- and dose­ response manner. AICAR treatment of E47 cells induces the plasmid vector expression containing CYP2El, this latter is not constitutive. Activation of AMPK by AICAR in both cell lines would not cause apoptosis and necrosis but an inhibition of cell proliferation. Furthermore, AICAR treatment is associated with an antioxidant response, in both cell lines, characterized by a stabilization of the transcription factor Nrf2, this regulates the gene expression coding for antioxidants. This stabilization is accompanied by an increase in cellular GSH content and a decrease in basal ROS production, presumably as consequences of AMPK activation. Last, CYP2E l does not affect cell viability and redox homeostasis in our model. Le stress oxydatif est défini comme un déséquilibre dans la cellule entre la production d'oxydants, telles que les espèces réactives de l'oxygène (ROS), et celle des défenses antioxydantes. Depuis quelques années, l'AMP-activated protein kinase (AMPK) apparaît jouer un rôle essentiel dans l'homeostasie redox, mais ses mécanismes d'action restent encore à élucider. Par ailleurs, CYP2E l, un cytochrome P450 qui contribue aux réactions de détoxification des xénobiotiques, est un producteur de ROS bien connu, présent au niveau du foie. Les objectifs de ce mémoire sont d'étudier le rôle de l'AMPK dans la régulation de la viabilité cellulaire et du stress oxydatif, ainsi que l'éventuelle influence de CYP2E l. L'étude a été réalisée sur deux lignées dérivées d'hépatocarcinome humain HepG2, transfectées de manière stable avec un vecteur d'expression contenant le gène codant pour CYP2El dans le cas des E47 et avec un vecteur contrôle dans le cas des C34. L'AICAR (5-aminoimidazole-4-carboxamide-1- -D-ribofuranoside) a été utilisé comme activateur de l'AMPK. Nous observons que l'activation de l'AMPK par l'AICAR dans les cellules E47 et C34 apparaît être temps- et concentration-dépendante. Le traitement à l'AICAR des cellules E47 induit l'expression du vecteur plasmidique contenant CYP2El, celle-ci n'est donc pas constitutive. L'activation de l 'AMPK dans les deux lignées ne provoquerait pas d'apoptose, ni de nécrose mais une inhibition de la croissance cellulaire. De plus, le traitement à l'AlCAR est associé à une réponse antioxydante caractérisée par une stabilisation du facteur de transcription Nrf2, qui régule l'expression de gènes codant des antioxydants. Cette stabilisation est accompagnée par une augmentation du contenu cellulaire en GSH et une diminution de la production basale de ROS, probables conséquences de l'activation de l'AMPK. Enfin, CYP2E 1 n'influence ni la viabilité cellulaire, ni l'homéostasie redox dans notre modèle d'étude.

AMP-Activated Protein Kinases --- Homeostasis --- Carcinoma, Hepatocellular

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Participant à laplupartdes transmissions excitatrices, le glutamate est un essentiel au sein du système nerveux central. Cependant, il doit impérativement être éliminé de la fente synaptique, afin d'éviter des phénomènes de neurotoxicité. Cette élimination est principalement assurée par les astrocytes, qui expriment des transporteurs membranaires spécifiques. Dans les tumeurs gliales (gliomes), cette homéostasie glutamatergique est fortement perturbée. Malgré leur origine souvent astrocytaire, les cellules de gliome sont incapables de capter efficacement le glutamate et, au contraire, en libèrent des quantités importantes. Les processus biochimiques régulant les transporteurs du glutamate dans le gliome restent peu documentés. Des expériences réalisées sur des modèles recombinants proposent que la kinase activée par I'AMP (AMPK) soit capable de réguler le transport du glutamate. En outre, des études en cours au sein de notre laboratoire suggèrent que cette kinase exerce une influence sur le transport du glutamate dans des astrocytes en culture primaire. Puisque I'AMPK semble être impliquée dans la progression de divers cancers, nous avons examiné le lien éventuel entre le degré d'activation constitutive de cette enzyme dans une lignée d'astrocytome, les cellules C6, et leur faible capacité à capter le glutamate. Nous avons d'abord déterminé que I'AMPK est constitutivement plus active dans notre modèle de gliome comparativement au modèle astrocytaire. Ensuite, par le biais de la différenciation astrocytaire forcée de cette lignée de gliome, nous avons montré qu'il est possible de réprimer l'activité constitutive de l'AMPK et de diminuer également l'expression de sa sous-unité catalytique al. Cette perte d'activité de l'AMPK s'est accompagnée d'une augmentation du transport du glutamate dans ces cellules en différenciation. Finalement, la manipulation génétique de l'expression de l’AMPKα1 s'est également révélée capable d'augmenter le transport du glutamate dans le modèle de gliome, appuyant ainsi notre hypothèse. La consolidation de ces travaux reste, cependant, nécessaire afin préciser la relevance de ces observations dans le développement du gliome. Glutamate is the principal excitatory neurotransmitter in the nervous system. However, elevated extracellular concentrations of this transmitter seem to be an important cause of neuronal death in a variety of nervous system diseases. Therefore, tight regulation of glutamate concentrations is important for normal brain function and is mainly ensured by glial cells, which express high affinity glutamate transporters. ln glia-derived tumors (gliomas), glutamate homeostasis was proven to be disrupted and this correlates with a reduced expression of specific glutamate transporters. ln fact, these cells are unable to efficiently take up glutamate from the synaptic cleft, leading to excitotoxicity in the vicinity of the tumor, thus potentially favoring tumor progression. However, the mechanisms regulating glutamate transporters in glial tumors remain unknown. Previous studies performed on recombinant models suggest that the cellular energy sensor AMP-activated protein kinase (AMPK) influences the activity of glutamate transporters. Moreover, recent work in our laboratory indicates that AMPK activation promotes a decrease of cell-surface expression of glutamate transporters, in primary cultures of astrocytes. Given that AMPK has been implicated in the progression of several tumors, we here propose the hypothesis for a functional link between the constitutive activation of AMPK previously reported in glial tumors, and the impaired glutamate uptake capacity of these cancer cells. Firstly, our data showed that the AMPK activity found in a rat glioma model (C6 cell line) is constitutively higher when compared to normal rodent astrocytes. Secondly, by driving differentiation of the glioma cell line into an astrocytic phenotype, we were able to reduce this constitutive AMPK activity and the expression of its al catalytic subunit. These changes were correlated with an increased activity and expression of glutamate transporters in C6 cells undergoing differentiation. Thirdly, preliminary results showed that genetic manipulation of AMPKα1 expression in naïve C6 cells promotes their glutamate uptake capacity. Together, our data suggest a putative link between the constitutive AMPK activity observed in glioma cells and their impaired capacity to take up glutamate. Further studies, including the analysis of other glioma cell lines and human glioma samples, should help to consolidate our hypothesis.

AMP-Activated Protein Kinases --- Glutamate Plasma Membrane Transport Proteins --- Glioma

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Diabetes Mellitus, Type 2 --- Insulin Resistance --- AMP-activated protein kinases