Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

Staphylococcus epidermidis is een Gram-positieve, van nature weinig pathogene huidbacterie. In het kader van vreemdlichaaminfecties, zoals infecties van katheters en prostethische instrumenten, wordt deze bacterie echter als één van de belangrijkste nosocomiale pathogenen beschouwd. Tijdens deze vreemdlichaaminfecties hechten bacteriën zich aan een vast oppervlak en worden ze vervolgens ingebed in een bacteriële gehydrateerde matrix van polysacchariden (zoals polysaccharide intercellulair adhesine of PIA) en proteïnen. Hier spreekt men van een biofilm: een gestructureerd geheel dat de bacterie meer resistent maakt tegen het immuunsysteem van de gastheer en de bacteriocide of bacteriostatische werking van antibiotica. Er werd reeds in vorige studies een verband gelegd tussen ijzer (Fe) en glucose enerzijds en de expressie van verschillende virulentiefactoren en biofilmvorming door S. epidermidis anderzijds. Het doel van deze studie was om dit verband verder te onderzoeken in vitro en in vivo, door middel van een rattenmodel voor vreemdlichaaminfecties. We bestudeerden het effect van Fe op de groei van planktonische en biofilm-vormende bacteriën. Eveneens bestudeerden we dit effect op de genexpressie van een aantal Fe afhankelijk regulerende genen (fur en sirR) en van een aantal genen (gapA, gapB en sitABC) waarvan de genproducten waarschijnlijk betrokken zijn bij Fe opname. Uit onze in vitro experimenten bleek Fe een effect te hebben op de groei van planktonische bacteriën. In een medium met Fe (vrij of gebonden) was het uiteindelijke aantal bacteriën in stationaire groeifase hoger dan het aantal bacteriën in een Fe gelimiteerd medium. In dit Fe gelimiteerd medium werd siderofoorproductie gedetecteerd. Hoewel bacteriën, in een medium met vrij Fe, geen sideroforen produceerden, hadden ze in een medium met gebonden Fe wel sideroforen nodig om te groeien. Biofilmvormende bacteriën hadden Fe nodig tijdens hun aanhechtingsfase. PIA-productie daarentegen leek gestimuleerd te worden in een medium zonder Fe. Buiten het effect van Fe op de groei, had Fe ook een effect op de morfologie van zowel sessiele (in vivo en in vitro) als planktonische (in vitro) bacteriën. Indien vrij Fe uit het medium werd verwijderd, werden bacteriële cellen waargenomen die groter waren dan normale Staphylococcus cellen en die morfologisch te vergelijken waren met 'small colony variants'. Niet alleen morfologische veranderingen door afwezigheid van vrij Fe werden waargenomen, ook transferrine zelf beïnvloedde de biofilmvorming: in een medium met apotransferrine werd vooral in de latere stadia van biofilmvorming een stamafhankelijk inhiberend effect waargenomen. In planktonische bacteriën was de expressie van sirR omgekeerd gecorreleerd met de expressie van sitC en de expressie van beide genen hing sterk af van de incubatiecondities. De expressie van de Fe afhankelijke regulator fur was hoger in een Fe gelimiteerd medium dan in een Fe rijk medium. Onafhankelijk van de concentratie van Fe, was de expressie van gapA uitgesproken hoger dan de expressie van gapB. GapA expressie op zich was hoger in een medium gelimiteerd aan Fe dan in een medium met vrij Fe. De expressiepatronen van deze genen verschilden voor sessiele en planktonische bacteriën. In sessiele bacteriën was, in vergelijking met planktonische bacteriën, het verband tussen sirR en sitC expressie minder uitgesproken. De expressie van beide genen was hoog in de initiële stadia van biofilmvorming. In latere stadia daalden de expressieniveaus en bleven ze uiteindelijk constant op dit lagere niveau. Fur expressie en eveneens gapA expressie waren duidelijk minder beïnvloed door de Fe concentratie. Ondanks deze lagere invloed van Fe op de expressie van gapA, was de expressie van gapB gevoeliger voor verschillende Fe concentraties: expressie van gapB steeg vroeger in een Fe gelimiteerd medium dan in een Fe rijk medium. Een inhiberend of stimulerend effect van apo- en holotransferrine op biofilmvorming was duidelijker op fenotypisch niveau dan op het niveau van genexpressie. Naast het effect van Fe werd eveneens het effect van glucose op de groei en genexpressie van planktonische en biofilmvormende bacteriën bestudeerd. Een hoge glucoseconcentratie was inhiberend voor bacteriële aanhechting, glucose werd gebruikt voor PIA-productie. Glucose had een positief effect op de expressie van gapA, maar een negatief effect op de expressie van gapB. Door middel van genexpressiestudies en metingen van de PIA-productie, werd het duidelijk dat glycolyse (GapA) en gluconeogenese (GapB) een verband vormden tussen aanwezige koolstofbronnen en de PIA-productie, zowel in sessiele als planktonische bacteriën. Dit verband was vooral duidelijk in een medium zonder glucose. Ons baserend op de constant hoge expressie van gapA in sessiele bacteriën, vooral in een in vivo rattenmodel, vermoeden we dat GapA, naast een katalysator in de glycolyse, eveneens een andere functie heeft. De constructie van gerichte mutanten in S. epidermidis is moeilijk via homologe recombinatie. We zijn er ondanks verscheidene pogingen niet in geslaagd om - door middel van elektroporatie met een temperatuursensitieve 'shuttle'vector pBT2 en homologe recombinatie - deletiemutanten te maken van de genen die we reeds bestudeerd hadden. Gedurende in vitro studies met een bestaande sitC-deletiemutant, werd duidelijk dat de SitABC transporter bij voorkeur ijzer opnam in vergelijking met mangaan. Omwille van een meer uitgesproken hemolytische activiteit bij de mutant werd duidelijk dat deze stam, in vergelijking met de "wild-type" stammen, een omschakeling gemaakt had naar opname van gebonden Fe. Daarenboven werd eveneens het bestaan van (een) ander(e) transportsyste(e)m(en) aangetoond, vermits gebonden Fe door de sitC-deletiemutant kon opgenomen worden en groei mogelijk was. Uit in vivo studies werd duidelijk dat sitC-deletie een tijdelijk positief effect had op biofilmvorming. Op dit tijdstip van hogere biofilmvorming - gebaseerd op het aantal bacteriën - was de expressie van fur hoger en de expressie van sirR lager in vergelijking met de respectievelijke expressieniveaus in de 'wild-type' stammen. Samenvattend heeft Fe een stimulerend effect op biofilmvorming tijdens de aanhechtingsfase. Het effect in latere stadia van biofilmvorming was echter minder uitgesproken, hoewel het leek dat de PIA-productie bevoordeeld werd door een lagere Fe concentratie. Deze fenotypische resultaten waren een bevestiging voor genexpressie studies van Fe afhankelijke regulatoren (sirR en fur) en van de genen die betrokken zijn in Fe opnamesystemen (sitABC). Expressie van sitC was hoog in de initiële stadia van biofilmvorming, wanneer Fe nodig was, en lager in latere stadia van biofilmvorming, resulterend in een lagere Fe opname. Hoewel een hoge glucoseconcentratie inhiberend was voor bacteriële aanhechting, werd glucose als koolstofbron voor PIA-productie gebruikt. Hiernaast kwam, via genexpressie-experimenten, een duidelijk verband, met name glycolyse en gluconeogenese, naar voor tussen PIA- en acetaatproductie en de aanwezige koolstofbronnen in planktonische en sessiele bacteriën. Staphylococcus epidermidis is a Gram-positive, opportunistic pathogen that is considered to be one of the most frequent causes of catheter-related and other foreign body infections. During these foreign body infections, S. epidermidis forms multi-layered cell aggregates embedded in an extracellular matrix mainly composed from polysaccharide intercellular adhesin (PIA). This is a biofilm and it makes the bacteria more resistant against both the host's immune system and antibiotics. Iron (Fe) and glucose concentrations have been linked to the expression of virulence factors and biofilm formation by S. epidermidis. The aim of this study was to gain further insight into these effects of glucose and Fe through in vitro and in vivo (foreign body infection rat model) experiments. We examined the effect of Fe on the growth of planktonic and biofilm-associated S. epidermidis and on the expression of genes involved in Fe regulation (fur and sirR) and several presumed Fe-scavenging systems (sitABC, gapA and gapB). In vitro studies revealed that Fe had an effect on growth of planktonic bacteria. In a medium with Fe (free or bound), bacterial yield in stationary growth stage was higher than in a medium without Fe. Siderophore production was detected in our strains in a medium depleted from Fe, but not in a medium with free Fe. In a medium with bound Fe, bacteria need siderophores to grow. In sessile bacteria, Fe is needed in the attachment phase during biofilm formation. Our data suggested that PIA production was, however, favoured in a medium without Fe. In sessile (in vivo and in vitro) and planktonic (in vitro) bacteria, depletion of free Fe from the RPMI medium has a morphological effect on the bacteria. Cells, phenotypical similar to small colony variants were observed with sizes larger than normal S. epidermidis cells. Besides morphological changes, apotransferrin also had a strain-dependent inhibitory effect, especially in later stages of biofilm formation. In planktonic bacteria, expression of sirR was inversely correlated with sitC expression. SirR expression depends on the incubation conditions. Fur expression levels were more elevated in an Fe-limited medium than in an Fe-rich medium. GapA expression was somewhat higher in an Fe-limited medium in comparison to its expression in an Fe-rich medium. However - irrespective of Fe content - expression of gapA was higher in comparison to expression of gapB. Our data suggest that the link between sirR and sitC expression is less stringent in sessile bacteria. The expression of sirR and sitC was elevated in the initial phase of biofilm formation and after a transient decrease remained constant, independently of the Fe content of the medium. Fur expression was not influenced by the Fe content of the medium. GapA expression was less influenced by Fe content in comparison to gapB expression, which was upregulated at an earlier stage in an Fe-limited medium than in an Fe-rich medium. The stimulating or inhibitory effect of holo- and apotransferrin was more obvious at the phenotypical level than at the gene expression level. We also examined the effect of glucose on the growth and PIA production of planktonic and biofilm-associated S. epidermidis and a possible glucose-dependent link between carbon metabolic pathways and PIA production through the expression levels of genes involved in glycolysis (gapA) and gluconeogenesis (gapB). High glucose concentration inhibited bacterial attachment. However, bacteria used glucose for PIA production. Glucose influenced the expression of gapA positively, and the expression of gapB negatively. Through these gene expression studies in vitro and measurements of the amounts of PIA produced, it became clear that glycolysis (gapA) and gluconeogenesis (gapB) are the link between carbon sources and PIA production in both planktonic and sessile bacteria. This was especially observed in a glucose-limited environment. In vivo studies showed a constant high expression of gapA over a two- weeks time period, which would indicate another role of GapA apart from glycolysis. Directed mutagenesis of S. epidermidis is very difficult. Several unsuccessful attempts were made to obtain deletion mutants of the genes studied making use of electroporation with the temperature sensitive shuttle vector pBT2 and homologous recombination. During in vitro experiments with an existing sitC deletion mutant of S. epidermidis, it became clear that the SitABC transporter favored iron uptake over manganese uptake. The haemolytic activity of this mutant strain was also more pronounced than that of the wild-type strain, indicating a more pronounced switch to Fe uptake from haem in the mutant strain in contrast to the wild-type strain. In vivo experiments revealed that the sitC mutation in S. epidermidis had a transiently positive effect on biofilm formation (1 week). At this point of high biofilm formation, a high expression of fur and a low expression of sirR were measured in the mutant strain in contrast to their expression levels in the wild-type strain, with a lower number of sessile bacteria. We conclude that Fe has a stimulating effect on biofilm formation during the attachment phase. In later phases of biofilm formation, the effect of Fe was less pronounced. Results of expression studies of Fe-dependent regulators (sirR, fur) or genes involved in Fe-scavenging systems (sitABC) were in line with our findings from phenotypic studies. Expression, especially of the sitABC operon was high in initial phases of biofilm formation, and low in later stages of biofilm formation resulting in lower Fe uptake. High glucose concentration inhibited attachment. Bacteria that form a biofilm, use glucose as carbon source for PIA production. Subsequently, at the gene expression level, we found a link between PIA and acetate production and available carbon sources via glycolysis (GapA) and gluconeogenesis (GapB) in planktonic and sessile bacteria.

Academic collection --- 577.2 --- 578 --- 579 --- Molecular bases of life. Molecular biology --- Virology --- Microbiology --- Theses --- 579 Microbiology --- 578 Virology --- 577.2 Molecular bases of life. Molecular biology

Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

RNA plays a central, and until recently, somewhat underestimated role in the genetics underlying all forms of life on earth. This versatile molecule not only plays a crucial part in the synthesis of proteins from a DNA template, but is also intrinsically involved in the regulation of gene expression, and can even act as a catalyst in the form of a ribozyme. This latter property has led to the hypothesis that RNA - rather than DNA - could have played an essential part in the origin of life itself. This landmark text provides a systematic overview of the exciting and rapidly moving field of RNA biology. Key pioneering experiments, which provided the underlying evidence for what we now know, are described throughout, while the relevance of the subject to human disease is highlighted via frequent boxes.

Moleculaire biologie --- 577.2 --- Molecular bases of life. Molecular biology --- 577.2 Molecular bases of life. Molecular biology --- RNA. --- ARN. --- Molecular biology. --- Biologie moléculaire. --- Molecular Biology. --- Molecular Biology

Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

Lactobacillen worden al eeuwen, al dan niet gecontroleerd, gebruikt in de fermentatie van levensmiddelen. Recent is er een vernieuwde interesse in deze groep van bacteriën voor hun mogelijk gezondheidsbevorderende, probiotische eigenschappen. Een probiotische bacterie wordt gedefinieerd als 'een levend micro-organisme dat, wanneer het wordt opgenomen in voldoende hoeveelheden, een gezondheidsvoordeel kan opleveren voor de gastheer'. Eén van de klinisch best gedocumenteerde probiotische bacteriën is Lactobacillus rhamnosus GG (LGG). Tot op heden hebben de meeste studies rond LGG zich vooral gericht op de beschrijving van de mogelijke gezondheidseffecten van deze bacterie. Voor een beter inzicht in de werkingsmechanismen van LGG is echter moleculaire kennis nodig over hoe deze bacterie zich aanpast aan en overleeft in de gastheer (adaptatiefactoren) en hoe deze bacterie op gerichte plaatsen in de gastheer tot gezondheidseffecten kan bijdragen (probiotische factoren). In dit doctoraatswerk werden een aantal moleculaire methoden geoptimaliseerd en geïmplementeerd, zoals de aanmaak van LGG mutanten voor specifieke genen, in vivo promoteranalyse, in vitro biofilmvorming en fluorescente in situ hybridisatie om de spatiële en temporele verdeling van bacteriën in de darm te visualiseren. Verder werd samengewerkt met andere onderzoeksgroepen om de celwandmoleculen (vnl. polysacchariden) en immunomodulatorische capaciteit van LGG in detail te bestuderen. De fenotypische analyse van een luxS knock-out mutant toonde aan dat LuxS een dubbele rol heeft in LGG, nl. de synthese van het interspecies AI-2 signaalmolecule en een centrale metabolische rol in de geactiveerde methylcyclus. Bovendien bleek dat LuxS belangrijk is voor de overleving van LGG in het maagdarmkanaal van muizen, en dit door de functie van LuxS in stressresistentie tegen ongunstige gastheerfactoren. Daarnaast werd ook de genencluster geïdentificeerd die instaat voor de biosynthese van extracellulaire polysacchariden (EPS) aan het oppervlak van LGG. Via de aanmaak van twee gerichte knock-out mutanten in EPS genen en de karakterisering van een spontane EPS mutant, werd de rol van EPS voor adhesie en biofilmvorming door LGG bestudeerd. EPS bleek de adhesiecapaciteit van LGG vooral negatief te beïnvloeden, waarschijnlijk door het afschermen van adhesiefactoren. Daarnaast bleek EPS zeer belangrijk voor overleving van LGG in het maagdarmkanaal van muizen. In vitro studies van de immunomodulatorische capaciteit van LGG tegen ontsteking veroorzaakt door de pathogeen Salmonella Typhimurium, samen met in vivo studies met een muismodel voor inflammatoire darmziekten, suggereren dat EPS van LGG mogelijk kan bijdragen tot zijn anti-ontstekingscapaciteit. De resultaten van dit onderzoek openen nieuwe perspectieven voor het beter begrijpen van de genen en moleculen van LGG die bijdragen tot de overleving in de gastheer en tot de probiotische, gezondheidsbevorderende effecten van deze bacterie. Dit moet uiteindelijk leiden tot een betere en meer gerichte toepassing van LGG en andere probiotische bacteriën. Lactobacilli have been crucial for the production of fermented products since centuries. Recently, increasing attention is given to their probiotic, health-promoting ability. A probiotic bacterium is 'a live micro-organism that, when administered in adequate amounts, confers a health benefit on the host'. One of the clinically best documented probiotics is Lactobacillus rhamnosus GG (LGG). Until now, studies of LGG have mainly focused on the description of a plethora of its health benefits. However, to advance the field, molecular knowledge on the survival and persistence of LGG in the host (adaptation factors) and the exertion of its beneficial effects at its 'site of action' (probiotic factors) is required to substantiate LGG's mode of action underlying its reported health-promoting effects. In this PhD work, a number of tools for the functional analysis of LGG have been optimized and implemented, including the construction of mutants in selected genes, in vivo promoter analysis, in vitro biofilm formation and fluorescent in situ hybridization to analyze the spatio-temporal organization of microbes in the host. Additionally, through various collaborations, several tools to study the macromolecules at the cell surface of LGG and to evaluate the immunomodulatory capacity of LGG were applied in the in vitro and in vivo phenotypic analysis of LGG dedicated knock-out mutants. Through construction of a luxS knock-out mutant, we showed that LuxS has a dual role in LGG, i.e. the production of the interspecies bacterial signaling molecule AI-2 and a central metabolic role in the activated methyl cycle. Furthermore, LuxS was found to be important for the optimal survival and persistence of LGG in the murine gastrointestinal tract and for the stress resistance of LGG against adverse conditions in the host. Additionally, the exopolysaccharides (EPS) gene cluster of LGG was identified and annotated, and two defined EPS mutants were constructed. Together with a spontaneous EPS mutant, these mutants were analyzed to investigate the role of EPS at the LGG cell surface. First, the EPS was biochemically characterized. Subsequently, the role of EPS in adhesion and biofilm formation by LGG was explored. EPS was shown to exert a negative effect on adhesion, most likely by shielding cell surface adhesins. Yet, EPS proved important for LGG to survive passage through the murine gastrointestinal tract. Additionally, in vitro immunomodulation assays with the pathogen Salmonella Typhimurium and in vivo experiments with a murine model for mild colitis suggest that EPS plays a role in the anti-inflammatory capacity of LGG. These findings open new perspectives for a better understanding of the role of genes and molecules of LGG that contribute to its adaptation and survival in the host and to its probiotic actions. Ultimately, this should lead to an optimized and more focused application of LGG and related probiotic strains. Een genetische kijk op probiotica Probiotica zijn levende micro-organismen die een positief effect hebben op onze gezondheid. Ze zijn ons beter bekend van de gefermenteerde zuiveldrankjes uit de supermarkt, zoals Yakult, Actimel en Activia. Volgens een recente enquête is bijna 1 consument op 2 een regelmatige gebruiker van probiotica. Ook in de medische sector worden probiotica alsmaar meer toegepast als ondersteunende therapie bij bepaalde ziektes of aandoeningen, vooral bij problemen met het spijsverteringsstelsel. Toch blijken ze niet altijd goed te helpen. Om beter te begrijpen wanneer en hoe probiotica het best worden toegediend, is het nodig om de probiotische bacteriën zelf in detail (genetisch) te bestuderen. In ons onderzoek gaan we na hoe ze zich aanpassen aan en overleven in de gastheer (adaptatiefactoren) en hoe ze tot gezondheidseffecten kunnen bijdragen (probiotische factoren). Uiteindelijk zal deze kennis bijdragen tot enerzijds een optimale productie van probiotica door de voedings- en farmaceutische industrie en anderzijds een verantwoord gebruik ervan door de consument of patiënt. LGG als een model probioticum In dit doctoraatsonderzoek onderzochten we de probiotische bacterie Lactobacillus rhamnosus GG (LGG). Dit is één van de klinisch best gedocumenteerde probiotica. Eerdere studies toonden reeds gunstige effecten aan bij de behandeling van verschillende vormen van diarree. Misschien wel de bekendste studie met LGG is een Finse studie die werd gepubliceerd in het toonaangevende tijdschrift The Lancet. Deze toonde aan dat LGG zuigelingen kan beschermen tegen de ontwikkeling van eczeem. In België is deze bacterie dan ook terug te vinden in babyvoeding. Tijdens dit doctoraatsonderzoek ontwikkelden we een aantal methoden ontwikkeld om dit 'model probioticum' genetisch te kunnen bestuderen, zoals het doelgericht uitschakelen van bepaalde genen, wat voordien nog niet mogelijk was. Metabolische rol van het LuxS eiwit belangrijk voor optimale werking van LGG Het eerste gen dat werd bestudeerd in LGG is het luxS gen. LuxS is een belangrijk metabolisch enzym dat ook zorgt voor de aanmaak van een signaalmolecule waarmee bacteriën met elkaar kunnen communiceren. Uitschakeling van het luxS gen toonde ondermeer aan dat de metabolische rol van LuxS nodig is voor LGG om in het maagdarmkanaal te kunnen overleven (adaptatiefactor). Dit is van belang voor de productie van LGG in allerlei voedingsmiddelen, waarbij de producent moet zorgen dat voldoende nutriënten voor LGG aanwezig zijn. Lange oppervlakte-suikerketens belangrijk voor optimale werking van LGG Daarnaast werd de rol van oppervlakte-polysacchariden van LGG bestudeerd door het uitschakelen van verschillende genen die belangrijk zijn voor de aanmaak van deze structuren. Deze lange suikers bleken een grote rol te spelen in de aanhechting en kolonisatie van het maagdarmkanaal door LGG (adaptatiefactor). De eerste studies met celkweek en diermodellen toonden ook aan dat polysacchariden van LGG kunnen bijdragen tot een ontstekingsremmende werking, wat een gunstig effect kan hebben door bepaalde ziektesymptomen te verlichten (probiotische factor). De aanmaak van deze oppervlakte-suikerketens kan ook sterk gestuurd worden door omgevingsfactoren, wat weerom nuttige informatie is voor de producent. Toekomstperspectieven Dit onderzoek heeft geleid tot belangrijke nieuwe inzichten in de functie van genen en moleculen van LGG die bijdragen tot overleving in het maagdarmkanaal en tot probiotische, gezondheidsbevorderende effecten van deze bacterie. Dit kan uiteindelijk leiden tot een meer efficiënte en meer gerichte toepassing van LGG en andere probiotische bacteriën in het belang van producent en consument of patiënt.

Academic collection --- 577.2 --- 579.864 --- 579.864 Lactobacillaceae. Lactobacillus --- Lactobacillaceae. Lactobacillus --- 577.2 Molecular bases of life. Molecular biology --- Molecular bases of life. Molecular biology --- Theses

Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

Molecular biology --- Biomembranes --- 576.314 --- 577.2 --- Membranes (Biology) --- -Molecular biology --- -Molecular biochemistry --- Molecular biophysics --- Biochemistry --- Biophysics --- Biomolecules --- Systems biology --- Cell membrane --- Molecular bases of life. Molecular biology --- Congresses --- Membranes --- Congresses. --- -Cell membrane --- 577.2 Molecular bases of life. Molecular biology --- 576.314 Cell membrane --- -577.2 Molecular bases of life. Molecular biology --- Molecular biochemistry --- Molecular biology.

Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

stofwisseling --- DNA (deoxyribonucleic acid) --- biochemie --- Histology. Cytology --- RNA (ribonucleic acid) --- genetica --- Molecular biology --- moleculaire biologie --- cytologie --- Celbiologie --- Moleculaire biologie --- Biochemie --- 577.2 --- Molecular bases of life. Molecular biology --- 577.2 Molecular bases of life. Molecular biology