Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

Omkeerbare fosforylering is een uiterst belangrijk mechanisme dat tussenkomt in de regulatie van vele cellulaire processen. Deze modificatie wordt bewerkstelligd door proteïne kinasen en fosfatasen. Proteïne fosfatase 2A (PP2A) is verantwoordelijk voor een groot deel van de serine/threonine defosforylerende activiteit in een cel en komt zo tussen in tal van signalisatie transductiewegen, waaronder celcyclus regulatie, cytoskelet organisatie, gen transcriptie en proteïne synthese. PP2A komt hoofdzakelijk voor als een heterotrimeer, opgebouwd uit een katalytische C subeenheid, een structurele A subeenheid en een regulerende B subeenheid. Tot op heden zijn er twee A subeenheden, twee C subeenheden en meer dan 20 B subeenheden geïdentificeerd. Bijgevolg bestaan er een groot aantal verschillende PP2A complexen, elk met een mogelijk specifieke functie. In deze studie hebben we onze aandacht gevestigd op de PP2A complexen die PR130 als regulerende B subeenheid bevatten (PP2AT130). PR130 is het grootste proteïne van de PR72/B" familie van regulerende subeenheden. De PR72/B" leden bevatten allen een goed geconserveerd centraal gedeelte met daarin twee Ca2+-bindende EF hand motieven. In het eerste gedeelte van dit werk hebben we de sequentie en genomische organisatie van de verschillende PR72/B" isovormen afgeleid bij de muis en dit als basis gebruikt om een aangepaste naamgeving voor de PR72/B" familie te introduceren. We vonden 4 transcripten (PR130/B"a1,a3; PR72/B"a2,a4) afgeleid van Ppp2r3a (waarvan PR130/B"a1 en PR72/B"a2 de belangrijkste zijn), 4 transcripten (PR59/B"d1,2,3,4) afgeleid van Ppp2r3d (waarvan PR59/B"d3 niet kan binden met PP2A en PR59/B"d4 in heel geringe mate aanwezig is) en 1 transcript (G5PR/B"g) afgeleid van Ppp2r3c. Alhoewel we PR70 isovormen terugvinden bij de mens, hond en kikker, is er bij de muis geen PR70 ortholoog aanwezig. Ook vonden we geen humaan ortholoog van de verschillende muize PR59/B"d isovormen. Hieruit kunnen we afleiden dat de PR72/B" familie, in vergelijking met PR55/B en PR61/B', een grotere diversiteit vertoont op evolutionair vlak. Via Northern blotting hebben we de weefselspecificiteit en de embryonale expressie van de belangrijkste muize PR72/B" isovormen onderzocht. Allen komen hoog tot expressie in het hartweefsel. Mogelijk hebben zij daar een belangrijke functie. Immunohistochemische analyse van hart en skeletspier toonde een gestreept expressiepatroon, de zogenaamde A band, aan voor PR130 en PR72. Daarnaast zagen we een epitheliale expressie voor PR130 in de blaas en nier. Voorts hebben we ook de subcellulaire lokalisatie en de impact op de celcyclus voor de verschillende B"/PR72 isovormen bepaald. Deze vertoonden zowel verschillen als gelijkenissen. Bovenstaande studie verstrekt waardevolle informatie voor de generatie en karakterisatie van toekomstige PR72/B" knock-out muizen. In het tweede gedeelte van dit werk hebben we geprobeerd meer inzicht te krijgen in de fysiologische functies die door PP2AT130 beïnvloed worden. In een eerste luik hebben we de capaciteit van IQ-1 om PP2AT130 en PP2AT72 in vitro en in vivo te inhiberen, nagekeken. Na IQ-1 toevoeging zagen we een reductie van de protamine gestimuleerde PP2AT130/72 activiteit, niettegenstaande we geen verschil in binding van PR130/72 met PP2A zagen. Verdere analyse is dus nodig vooraleer we deze stof kunnen gebruiken om in vivo specifiek PP2AT130 te inhiberen. In een tweede luik hebben we PR130-interagerende proteinen geïdentificeerd via de gist dubbel-hybride methode met PR130N als aas en via massaspectrometrische identificatie van proteïnen die coïmmunoprecipiteren met PR130. Beide strategieën hebben geleid tot de identificatie van LPP, een proteïne belangrijk voor de communicatie tussen celadhesieplaatsen en de kern. Hoewel LPP en PR130 zich beide bevinden in focale contacten en aan de frontale celmembraan van migrerende cellen, is enkel LPP aanwezig in focale adhesies. We konden aantonen dat PR130 een negatieve invloed heeft op cel-matrix adhesie en dat het LPP-PP2AT130 complex noodzakelijk is voor een efficiënte celmigratie. Daarnaast zagen we, afhankelijk van het celtype, een dynamische expressie van PR130 in de kern. De functie(s) van PR130 in de kern zijn voorlopig nog onbekend. SHIP2, een inositol en fosfoinositide 5'-fosfatase werd ook geïdentificeerd als een PR130-interagerend proteïne. Dit proteïne bindt ondermeer aan de EGF receptor (EGFR) en heeft een negatief effect op EGFR degradatie. We hebben kunnen aantonen dat ook PR130 associeert met de EGFR en een negatieve invloed heeft op de EGF-geïnduceerde EGFR degradatie. Bovendien translokeert PR130 net als SHIP2 naar de celmembraan na EGF stimulatie. Momenteel zijn we de hypothese aan het onderzoeken dat PR130 een brug vormt tussen SHIP2 en de EGFR en zo SHIP2 helpt om de EGFR degradatie te beïnvloeden. Uit bovenstaande gegevens kunnen we besluiten dat PR130 een negatieve invloed heeft op cel adhesie en EGFR degradatie en een positieve rol speelt tijdens cel migratie. Cel adhesie en migratie spelen een belangrijke rol tijdens de ontwikkeling van kanker. Daarnaast is geweten dat EGFR hyperactivatie correleert met verschillende soorten kanker. Bijgevolg suggereren deze data dat PR130 mogelijks een tumor promoverende functie vervult. Reversible protein phosphorylation is an important regulation mode of most cellular processes, and is controlled by the action of protein kinases and phosphatases. Protein phosphatase 2A (PP2A) accounts for a significant serine/threonine phosphatase activity in cells and has been implicated in the regulation of many signalling pathways involved in the control of cell division, cytoskeleton organisation, gene transcription and protein biosynthesis. PP2A mainly exists as heterotrimeric complexes made up of a catalytic C subunit, a structural A subunit and a regulatory B-type subunit. To date in mammalian cells, two A subunits, two C subunits, and over twenty B-type subunits have been identified, giving rise to numerous PP2A complexes, each potentially serving distinct functions. In this study, we focused on the PP2A complexes containing PR130 as a regulatory B-type subunit (PP2AT130). PR130 is the longest isoform of the PR72/B" regulatory subunit family. All PR72/B" members share a highly conserved 'central' region with two Ca2+-binding EF hand motifs. In the first part of this work, we deduced the sequences and genomic organisation of the different murine PR72/B" isoforms, which served as a basis to introduce an adapted B" nomenclature. We found that four transcripts (PR130/B"a1,a3; PR72/B"a2,a4) can be derived from Ppp2r3a (of which PR72/B"a2 and PR130/B"a1 are the main splice variants), four transcripts (PR59/B"d1,2,3,4) arise from Ppp2r3d, (of which PR59/B"d3 cannot bind PP2A and PR59/B"d4 is not very abundant), and only one transcript (G5PR/B"g) arises form Ppp2r3c. Although PR70/B"b is present in man, dog and frog, no murine PR70 orthologue could be found. Similarly, no human orthologues of the murine PR59/B"d isoforms are present. Therefore, the PR72/B" family seems evolutionary more divergent than the PR55/B and PR61/B' families. We further examined the tissue-specific and developmental expression of the main murine PR72/B" isoforms via Northern blotting. All subunits are highly expressed in heart, suggesting an important cardiac function. Immunohistochemical analysis revealed a striated expression pattern of PR72 and PR130 in heart and skeletal muscle, coinciding with the A-band, alongside an epithelial localisation of PR130 in bladder and kidney at the apical side of the cells. Finally, the subcellular localisation and cell cycle regulatory ability of several PR72/B" isoforms were determined, demonstrating differences as well as similarities. Together, these data provide valuable information for the future generation of PR72/B" knock-out mice. In the second part of this work, we tried to gain more insight into the physiological functions modulated by PP2AT130. In a first approach, we tested the ability of IQ-1, a compound which targets PR130 and PR72, to inhibit PP2AT130 and PP2AT72 in vitro and in vivo. We observed a reduction in protamine-stimulated PP2AT130/72 activity, although we did not see any differences in PP2A binding to PR130/72. Further analysis is thus needed before this compound can be safely used as a specific PP2AT130/72 inhibitor in living cells. In a second approach, we identified PR130-interacting proteins via a yeast two-hybrid screening with the PR130 specific N-terminus as bait, as well as via mass spectrometrical identification of proteins specifically co-immunoprecipitating with PR130.  Both strategies led to the identification of LPP, a protein involved in the communication between cell adhesion structures and the nucleus. Although LPP and PR130 are both found at focal contacts and at the leading edge of migrating cells, PR130 - in contrast with LPP - is not present in focal adhesions. We demonstrated that PR130 has a negative effect on cell-matrix adhesion and that the LPP-PP2AT130 complex is necessary for efficient cell migration. We also demonstrated a dynamic nuclear distribution of PR130 which varied depending on the cell line. The nuclear function of PR130 remains to be determined. SHIP2, an inositol and phosphoinositide 5'-phosphatase, was also identified as a PR130 interactor. This protein has been reported to bind the EGF receptor (EGFR) and negatively modulate its ligand-induced degradation. We have demonstrated that PR130 can also bind EGFR and similar to SHIP2, reduces EGF-stimulated EGFR degradation. Moreover, like SHIP2, PR130 partially translocates to the cell membrane upon EGF stimulation. We hypothesised that PR130 may serve as a scaffold, bringing SHIP2 and EGFR in close contact and thus enabling SHIP2 to affect EGFR degradation. We can conclude that PR130 negatively influences cell adhesion and EGFR degradation and positively influences cell migration. Cell detachment and migration are vital processes in the progression of cancer. Furthermore, EGFR overactivation has been reported to correlate with various kinds of cancers. Therefore, our data could imply a positive role for PR130 in tumourigenesis. Proteïne fosfatase 2A (PP2A) is een serine/threonine fosfatase belangrijk voor de regulatie van tal van cellulaire processen. Op deze manier is PP2A verbonden met verschillende humane ziektes waaronder neurodegeneratieve ziektes (zoals Alzheimer ) en kanker. PP2A is een enzyme opgebouwd uit 3 verschillende typen subeenheden: een katalytische C subeenheid, een structurele A subeenheid en een regulatorische B subeenheid. Er bestaan meer dan 20 verschillende regulatorische B subeenheden en deze zijn op basis van hun structuur onderverdeeld in drie families; de PR55/B, PR61/B' en PR72/B" familie. De regulatorische B subeenheden zijn verantwoordelijk voor de verschillende functies van PP2A doordat ze het enzyme naar verschillende subcellulaire lokalisaties of naar verschillende substraten leiden. Het doel van deze studie was het verder ophelderen van de functies van PR130 bevattende PP2A complexen. PR130 is een lid van de PR72/B" familie van regulatorische subeenheden. In het 1e deel van deze doctoraatsthesis hebben we de genomische organisatie en proteïne expressie van de verschillende PR72/B" familieleden onderzocht in de muis en vergeleken met de situatie in de mens. Zo vonden we dat de PR72/B" familie in zoogdieren wordt vertegenwoordigd door 4 genen (PPP2R3A-D). Een van deze genen, zijnde Ppp2r3d, is enkel aanwezig in de muis terwijl het PPP2R3B gen juist niet aanwezig is in dit organisme. In de muis zijn er 6 veel voorkomende PR72/B" familieleden: PR130/B"a1, PR72/B"a2, G5PR/B"g, PR59/B"d1, PR59/B"d2 en PR59/B"d3. Voorts hebben we de weefselexpressie, expressie tijdens de ontwikkeling, subcellulaire lokalisatie en invloed op de cel cyclus voor de verschillende PR72/B" leden bepaald. Opmerkelijk was dat alle PR72/B" subeenheden hoog tot expressie komen in het hart, wat kan wijzen of een belangrijke rol in dit weefsel. Deze studie levert waardevolle informatie voor de generatie en karakterisatie van toekomstige PR72/B" knock-out muizen. In een tweede deel van deze thesis hebben we de functie van PR130 bevattende PP2A verder bestudeerd. We hebben de werking van IQ-1, een nieuwe component die PR130 en PR72 bindt, geëvalueerd. Alhoewel we konden vaststellen dat deze component inderdaad de PR130-bevattende PP2A activiteit reduceert, is verdere analyse nodig vooraleer kan besloten worden dat bekomen effecten alleen te wijten zouden zijn aan deze inhibitie. Daarnaast zijn we ook op zoek gegaan naar eiwitten die binden met PR130. Dit leidde tot de identificatie van LPP. Dit eiwit is noodzakelijk voor de communicatie tussen de plaatsen van focale adhesie en de celkern . We hebben de invloed van PR130 op cel adhesie en migratie getest. Hieruit bleek dat PR130 een negatieve invloed heeft op cel adhesie en het PR130-LPP complex noodzakelijk is voor efficiënte cel migratie. Het loskomen van cellen en cel migratie zijn belangrijke processen bij de ontwikkeling van kanker en metastase. Deze informatie suggereert een stimulerende rol voor PR130 in tumor progressie. Behalve LPP, werd ook SHIP2 geïdentificeerd als een eiwit dat bindt met PR130. SHIP2 is een inositol en fosfoinositide fosfatase dat na Epidermale GroeiFactor (EGF) stimulatie naar de celmembraan translokeert, daar bindt met de EGF receptor en zo de degradatie van deze receptor tegengaat. Wij konden aantonen dat PR130 ook translokeert naar de celmembraan na EGF stimulatie. Voorts zagen we dat PR130 kan binden met de EGF receptor en de degradatie ervan tegengaat. EGFR signalisatie is belangrijk voor cel proliferatie. Overactivatie van deze transductieweg zorgt voor een ongecontroleerde celgroei, wat kan leiden tot tumorontwikkeling. Het is dus belangrijk dat EGFR signalisatie ten gepaste tijde verdwijnt. Uit het 2e luik van deze studie kunnen we besluiten dat PR130 mogelijk een positieve invloed heeft op tumor ontwikkeling en progressie. Verdere analyse van deze subeenheid zal uitwijzen of inhibitie van PR130, bijvoorbeeld door IQ-1 toevoeging, een hoopvol middel zou kunnen vormen in de bestrijding van enkele specifieke kankers. Protein phosphatase 2A (PP2A) accounts for a significant serine/threonine phosphatase activity in cells and has been implicated in the regulation of many signalling pathways involved in the control of cell division, cytoskeleton organisation, gene transcription and protein biosynthesis. This way, PP2A is linked with several human diseases, including Alzheimer's disease and cancer. PP2A mainly exists as heterotrimeric complexes made up of a catalytic C subunit, a structural A subunit and a regulatory B-type subunit. To date in mammalian cells, two A subunits, two C subunits, and over twenty B-type subunits have been identified, giving rise to numerous PP2A complexes, each potentially serving distinct functions. In this study, we focused on the PP2A complexes containing PR130 as a regulatory B-type subunit. PR130 is a member of the PR72/B" regulatory B-type subunit family. In the first part of this work, we deduced the sequences and genomic organisation of the different murine PR72/B" isoforms. In mammals, the PR72/B" family is represented by four genes (PPP2R3A-D). One of these genes, Ppp2r3d is only present in mice while another, PPP2AR3B is absent in mice. In mice 6 abundantly expressed PR72/B" family members are present: PR130/B"a1, PR72/B"a2, PR59/B"d1,2,3 and G5PR/B"g. We examined the tissue-specific and developmental expression, subcellular localisation and influence on cell cycle progression of the main murine PR72/B" isoforms. Remarkably, all subunits are highly expressed in heart, suggesting an important cardiac function. Together, these data provide valuable information for the future generation and characterisation of PR72/B" knock-out mice. In the second part of this work, we tried to gain more insight into the physiological functions modulated by PP2AT130. In a first approach, we worked with IQ-1, a compound which targets PR130 and PR72. After IQ-1 treatment, we observed a reduction in the PR130-containing PP2A enzyme activity. Further analysis is needed to determine the specificity of this component. In a second approach, we searched for proteins which interact with PR130 and found that LPP binds PR130. LPP is involved in the communication between cell adhesion structures and the nucleus. We tested PR130's influence on cell adhesion and migration. We could demonstrate that PR130 has a negative effect on cell-matrix adhesion and that the LPP-PP2AT130 complex is necessary for efficient cell migration. Cel detachment and migration are important processes during the development of cancer and metastase. Our data suggests a stimulatory role for PR130 in tumour progression. SHIP2, an inositol and phosphoinositide 5'-phosphatase, was also identified as a PR130 interactor. Upon epidermal growth factor (EGF) stimulation, SHIP2 translocates to the cell membrane where it binds the EGF receptor and diminishes its degradation. We could prove that PR130 also translocates to the cell membrane upon EGF stimulation. Furthermore, PR130 binds the EGF receptor and reduces its degradation. EGFR signalling is important for cell proliferation. Overactivation of this pathway correlates with unregulated cell growth, leading to tumour development. Consequently, termination of EGFR signalling is crucial to avoid tumour formation. We can conclude that PR130 might have a positive role in tumour development and progression. Further analysis of this protein is necessary to evaluate whether PR130 could become an interesting novel target in the development of anticancer therapeutics.

Academic collection --- 577 --- Material bases of life. Biochemistry. Molecular biology. Biophysics --- Theses --- 577 Material bases of life. Biochemistry. Molecular biology. Biophysics