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Resting membrane potential of vascular smooth muscle cells (SMC) of hypertensive rats is depolarised compared to that of normotensive rats. Voltage-gated potassium channels (Kv) and Na/K-ATPase play an important role in the control of resting membrane potential. The aim of the present study was to determine whether hypertension was associated with change in K+ channels or in sodium pump expression in arteries.
We have used L-NAME prevents vascular relaxation. Chronic treatment of rats with L-NAME is known to induce hypertension. Rats were divided in two groups: one group was treated for four (first series) or five (second series) weeks with L-NAME diluted in drinking water and the other served as control.
Systolic blood pressure was increased by 85 mm Hg (50% of the value in control rats) at the end of treatment in L-NAME rats compared with control rats. The body weight didn’t change significantly but the heart weight was increased in L-NAME rats.
The expression of different Kv sub-types and of the isoforms of the αsubunit of the sodium pump was studied by Western blot and RT-PCR in aorta and in mesenteric artery.
Western blot experiments didn’t reveal any difference in Kv 1.5, kv 2.1 and kv 3.4 expression between L-NAME-rat and control rat aortas . Kv 1.5, Kv 2.1 and kv3 were investigated by RT-PCR in aorta and mesenteric artery, and kv 4.3 in aorta only.No significant difference was observed between controls and L-NAME-rats, although Kv 2.1 and kv 4.3 expression was lower in L-NAME-treated rat aorta. Potassium current recording in mesenteric artery SMC by the patch-clamp technique didn’t reveal any difference in current density between L-NAME and control rats. However, inactivation curves were slightly different. Therefore, it would be interesting to collect more data to draw clear conclusions.
α is the most abundant of the three αsubunit isoforms of the sodium pump (α1, α 2 and α 3) identified in aorta and mesenteric artery by RT-PCR. Α 1 isoform expression was increased rats compared to controls Les myosites des artères des rats hypertendus ont un potentiel de repos dépolarise par rapport à ceux des rats mono tendus. Or les canaux potassiques voltage-dépendants (KV) ainsi que la NA/K-ATPase jouent un rôle important dans l’établissement et le maintien potentiel de repos. L’objectif de ce travail était donc de déterminer si l’hypertension est associée à une modification au niveau des canaux potassiques ou de la pompe à sodium des artères.
Comme modèle de rat hypertendu, nous avons utilisé le rat Wistar Kyoto traité au L-NAME. Cet inhibiteur de la NOS s’oppose à la relaxation vasculaire et de ce fait, son administration chronique induit une hypertension. Nous avons réparti les rats en deux groupes dont l’un à été traité durant quatre (première série) ou cinq (deuxième série) semaines avec du L-NAME dilué dans l’eau de boisson alors que l’autre groupe a servi de contrôle.
La tension artérielle systolique a augmenté de 85 mm de Hg (50%) en fin de traitement chez les rats L-NAME en comparaison avec les rats contrôles. Par ailleurs le poids des rats n’a pas diminué significativement mais le poids du cœur était plus élevé chez les rats L-NAME.
L’expression de différents sous-types de KV et des iso formes de la sous-unité α de la pompe à sodium à été étudiée par western blots et RT-PCR tant au niveau de l’aorte que de l’artère mésentérique. En western blots nous n’avons pas observé de différence d’expression de KV 1.5, KV 2.1 et de KV 3.4 dans l’aorte entre rats contrôles et rats L- NAME. En RT-PCR, nous avons évalué l’expression de V 1.5, KV 2.1, KV3.4 dans l’aorte et l’artère mésentérique et KV4.3 uniquement dans l’aorte. Nous n’avons décelé aucune différence significative entre rats contrôles et rats traités, même si une tendance à la diminution du KV2.1, et du KV 4.3 était observée dans l’aorte des rats L-NAME. L’enregistrement des courants potassiques dans des cellules de l’artère mésentérique par la technique du patch-clamp n’a pas montré de différence de densité de courant chez les rats L-NAME. Cependant, les courbes d’inactivation laissaient soupçonner un profil différent. Toutefois, il serait judicieux de collecter un nombre plus grand de données pour en tirer des conclussions nettes.
Les trois iso formes de la sous-unité α e la pompe à sodium, α1, α2, α3, ont été identifiées dans l’aorte et l’artère mésentérique par RT-PCR. Α1 est l’iso forme la plus abondante dans les deux artères. L’expression de l’iso forme α1 était augmentée chez les rats L-NAME tant dans l’aorte que dans l’artère mésentérique

Rats, Inbred WKY --- Potassium Channels, Voltage-Gated --- Arteries --- NG-Nitroarginine Methyl Ester

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In this work, we characterized the potassium current in three types of preparations : vascular smooth muscle cells (VSMCs) isolated enzymatically from the mesenteric artery of Wistar and Wistar Kyoto (WKY) rats, and cells in primary culture obtained from the Wistar mesenteric artery by the explant procedure. We tried to determine the involvement of three isoforms of the voltage-dependent potassium channel in this potassium current : Kν1.5, Kν2.1 and Kν3.4.
In a first step, we had to demonstrate these Kν isoforms in the tissue and cells examined. We used two techniques : Western Blotting, to investigate protein expression, and RT-PCR, to analyze mRNA levels. Semi-quantitative RT-PCR was more successful than Western Blotting, allowing us to conclude thath : (1) the three isoforms, but mainly Kν2.1, were expressed in enzymatically isolated WSMCs, whereas only Kν2.1 was detectable in explant-derived cultured cells ; (2) the expression level of Kν1.5 was distinctly higher on WKY than in Wistar rats.
The patch-clamp technique allowed us t measure the global electrophysiological activity of Kν channels in enzymatically isolated cells (Wistar and WKY) and cultured cells (explant). We analyzed the current intensity (in Ca-free solution) and the degree of inactivation as a function of voltage. Our results indicate that : (1) the Kν density was distinctly higher in VSMCs from WKY compared to those from Wistar rats ; (2à Kν current inactivated at more in VSMCs from WKY compared to those from Wistar rats ; (3) in cultured cells (explant), the Kν density was very low.
Although the patch-clamp data were compared with those from RT-PCR, we cannot conclude that Kν3.4 plays a major role in the differences observed in patch-clamp experiments between Wistar and WKY rats, because (1) this isoform seemed to be expressed only weakly is VSMCs from mesenteric artery, even in WKY rats, and (2) our RT-PCR analysis was restricted to three isoforms Dans ce travail, nous avons caractérisé le courant potassique dans trios types de préparations : des cellules musculaires lisses vasculaires (CLMVs) isolées enzymatiquement à partir d’artère mésentérique de rats Wistar et Wistar Kyoto (WKY) et des cellules en culture primaire provenant d’explant d’artère mésentérique de rat Wistar. Nous avons tenté de déterminer l’implication de trois isoformes des canaux potassiques voltage)dépendants (Kν) dans ce courant K+ : les Kν1.5, Kν2.1 et Kν3.4.
Dans un premier temps, il fallait s’assurer de la présence de ces Kν dans les tissus à analyser. Deux techniques ont été utilisées : le Western Blot, qui nous indique si ces protéines sont exprimées, et la RT-PCR semi-quantitative, qui nous renseigne sur la présence d’ARNm de ces canaux. C’est essentiellement grâce à la RT-PCR semi-quantitative que nous pouvons conclure que (1) les trois isoformes, mais surtout le Kν2.1, sont exprimées dans les CMLVs isolées enzymatiquement, alors que seul Kν2.1 est détectable dans les cellules cultivées à partir d’explant ; (2) l’expression des Kν au niveau des artères mésentériques de rats Wistar et WKY sont équivalentes en ce qui concerne les Kν1.5 et Kν2.1, alors que l’expression des Kν3.4 est nettement plus importante chez les rats WKY que chez les rats Wistar.
La technique du patch clamp nous a permis de mesurer l’activité électrophysiologique globale des Kν au niveau de cellules obtenues enzymatiquement (Wistar et WKY) et de cellules cultivées à partir d’explant. Des analyses d’intensité de courant potassique (solutions sans Ca2+) en fonction du voltage ainsi que des courbes d’inactivation en fonction du voltage ont été effectuées. Les résultats obtenus indiquent que (1) la densité des canaux potassiques est nettement plus élevée au niveau des CMLVs de rats WKY que dans les CMLVs des rats Wistar ; (2) les Kν s’inactivent à des voltages plus positifs dans les cellules de rats WKY que dans celles de rats Wistar ; (3) avec les cellules d’explant, la densité de courant potassique observée est très faible.
Bien que les résultats obtenus en patch clamp soient compatibles avec ceux fournis par la RT-PCR, nous ne pouvons conclure que le Kν3.4 joue un rôle majeur dans les différences observées en patch clamp entre rats Wistar et WKY, puisque un rôle majeur dans cet isoforme paraît peu exprimé dans l’artère mésentérique, même chez le rat WKY, et que d’autre part notre analyse en RT-PCR s’est limitée à 3 isoformes

Myocytes, Smooth Muscle --- Potassium Channels, Voltage-Gated --- Mesenteric Arteries --- Rats

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L’objectif de ce travail était de déterminer la localisation subcellulaire des récepteurs de la ryanodine et de l’IP3 dans le muscle lisse, par une approche basée sur le fractionnement de l’homogénat tissulaire dans diverses conditions.
la distribution subcellulaire de ces récepteurs n’avait pas encore été établie de manière quantitative. De plus, les expériences de type fonctionnel suggéraient l’existence dans le muscle lisse intestinal de compartiments membranaires différents susceptibles de contenir soit les deux récepteurs simultanément, soit uniquement le récepteur de l’IP3 (IINO, 1990 ; voir Discussion). Il était donc intéressant de rechercher si ces deux compartiments pouvaient être distingués par les techniques de centrifugation.
La réalisation de cet objectif a nécessité, dans un premier temps, ma mise au point d’une technique de dosage des récepteurs de l’IP3 de 3H-IP3, car cette technique n’était pas disponible au Laboratoire de pharmacologie.
Cette technique m’a permis de caractériser les propriétés du site de liaison spécifique de l’IP3 dans le muscle lisse intestinal.

Receptors, Cell Surface --- Muscle, Smooth --- Inositol 1,4,5-Triphosphate --- Ryanodine --- Medical Laboratory Science