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The aim of our work was to produce soluble class II HLA complexes HLA-DP4, loaded with a peptide from the MAGE-3 tumoral antigen. These complexes will be used to from fluorescent tetramers for the analysis of the anti-tumoral T helper response of patients vaccinated with the MAGE-3 peptide. Two methods were valuated : i) the production of these complexes from recombinant proteins expressed by bacterial systems and refolded in vitro, ii) the expression of these complexes by insect cells.
We evaluated the production of the complexes from the fusion protein of β1 and α1 domains expressed by bacteria. The refolding of this protein only allowed to obtain high molecular weight complexes and a dimmer of the fusion protein. The high molecular complexes are able to stimulate the production of IFN-γ by a CD4+ T-Cell clone directed against anti-MAGE-3.DP4 and isolated from a vaccinated cancerous patient. This indicates that in these complexes molecules exist loaded with the antigenic peptide and are in adequate conformation to present it.
We also produced MAGE-3.DP4 complexes secreted by Drosophila cells. The biological function of the secreted complexes was then confirmed by their ability to stimulate the production of IFN-γ by anti-MAGE-3.DP4 CD4+ T-Cell clones. Finally, we selected and maintained in culture transfected Drosophila cells that secrete MAGE-3.DP4 complexes in a stable manner. After purification, these complexes will be ready for the production of fluorescent tetramers. These tetramers will be tested for their ability to specifically label the anti-MAGE-3.DP4 CD4+ T-Cell clones before their use in the analysis of anti-tumoral T helper response of vaccinated patients Le but de notre travail était la production de complexes HLA de classe II solubles HLA-DP4, charges d’un peptide issu de l’antigène tumoral MAGE-3. Ces complexes serviront à former des tétramères fluorescent pour l’analyse la réponse anti-tumorale T auxiliaire chez des patients vaccinés à l’aide du peptide MAGE-3-DP4. Deux approches ont été évaluées : i) la production des complexes à partir de protéines recombinantes exprimées en système bactérien et reployées in vitro, ii) l’expression des complexes en cellules d’insectes.
Nous avons évalué la production des complexes à partir d’une protéine de fusion des domaines β1 et α1 exprimée en bactérie. Le reploiement de cette protéine n’a permis d’obtenir que des complexes de haut poids moléculaire aussi qu’un dimère de la protéine de fusion. Les complexes de haut poids moléculaire sont capables de stimuler la production d’IFN-γ par un clone de lymphocyte T CD4+ anti-MAGE3.DP4, isolé d’un patient cancéreux vacciné. Ceci indique qu’il existe dans ces complexes des molécules chargées du peptide antigénique et dans une conformation adéquate pour la présentation de l’antigène.
D’autre part, nous avons produit des complexes MAGE-3.DP4 sécrétés par des cellules de Drosophile. La fonction biologique des complexes sécrétés a ensuite été confirmée par leur capacité à stimuler différents clones de lymphocytes T CD4+ anti-MAGE3.DP4 pour la production d’IFN-γ. Enfin, nous avons sélectionné et maintenu en culture des cellules de Drosophile transfectées qui sécrètent de façon stable les complexes MAGE-3.DP4. Après avoir été purifiés, ces complexes pourront servir à la production de tétramères fluorescents.
Ces tétramères seront testés pour leur capacité à marquer spécifiquement les clones de lymphocytes T CD4+ anti-MAGE-3.DP4 avant d’être utilisés pour l’analyse de la réponse anti-tumorale T auxiliaire chez des patients cancéreux vaccinés

Antigens, Neoplasm --- MAGEA3 protein, human --- T-Lymphocytes