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The GLOMULIN gene (GLMN), which codes for a protein of the same name, was identified in the laboratory of Prof Miika Vikkula, where this thesis was undertaken. This gene, when mutated, is responsible for a particular sub-type of vascular anomaly: glomuvenous malformations (GVM). GVMs are cutaneous lesions charaterized by enlarged venous channels, surrounded by abnormally-differentiated vascular smooth muscle cells (vSMCs), called “glomus cells”. GLOMULIN protein is normally expressed by vSMCs, and seems to play a role in their differentiation, through interactions with components of the TGFb and HGF signaling pathways. A variety of double-hits that cause complete localized absence of GLOMULIN, have been identified in the context of GVM lesions. While studies have yielded many insights into the nature of this molecule, the precise function of GLOMULIN remains to be unravelled. The aim of this thesis, therefore, was a detailed assessment of GLOMULIN expression, in order to further our understanding of the protein and its functions.
In the course of this study, we characterized a commercially available antibody to GLOMULIN, which we then used in order to analyze expression of the protein in healthy and GVM-tissue by immunohistochemistry. The antibody being specific for the human protein, we studied Glmn expression during development using in situ hybridization instead, to assess for RNA-expression in paraffin-sections derived from mouse embryos. Thus, the expression of this molecule in wild-type mice at different developmental stages, was compared to that of a variety of other vSMCmarkers, tools which will allow for better characterization of GLOMULIN expression in human tissues, as well as in knock-out and transgenic mice Le gène GLOMULINE (GLMN), codant pour une protéine du même nom, a été identifié au sein du laboratoire hôte de ce mémoire. Ce gène, lorsqu’il est muté, est responsable d’un sous-type d’anomalies vasculaires : les malformations glomuveineuses (GVM). Les GVM sont des lésions cutanées qui se caractérisent par un élargissement des canaux veineux et par la présence, autour de ces vaisseaux, de cellules musculaires lisses mal différenciées, nommées cellules glomiques. La protéine GLOMULINE est normalement exprimée par les cellules musculaires lisses vasculaires. Il semble que cette protéine joue un rôle dans la différenciation de ces cellules en interagissant avec des éléments des voies de signalisation du TGFβ et du HGF. Il a également été identifié, au sein des lésions glomuveineuses, différents doubles hits qui entrainent une absence localisée de la GLOMULINE. Malgré les connaissances que nous possédons sur ce gène et sa protéine, la fonction de la GLMN reste encore méconnue. Le but de ce mémoire était, dès lors, d’acquérir une connaissance plus précise sur l’expression de cette protéine, afin que nous puissions par la suite mieux comprendre sa (ses) fonction(s).
Au cours ce mémoire, nous avons caractérisé un anticorps commercial dirigé contre la GLOMULINE, afin d’analyser par immunohistochimie l’expression de cette protéine dans des tissus sains et pathologiques. Cet anticorps ne reconnaissant que la protéine humaine, nous avons également adapté la technique d’hybridation in situ pour caractériser l’expression de l’ARN de Glmn sur des coupes en paraffine d’embryons de souris. L’expression de la Glmn, chez des souris sauvages à différents stades embryonnaires, a été comparée à celle d’autres marqueurs de cellules musculaires lisses. Ces outils pourront, par la suite, être utilisés pour compléter la caractérisation de l’expression de la GLOMULINE, d’une part dans les tissus humains, et d’autres part chez les souris knock out et transgéniques

GLMN protein, human --- Central Nervous System Vascular Malformations --- Vascular Diseases --- Transforming Growth Factor beta --- Myocytes, Smooth Muscle

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Le cancer du sein est le cancer le plus fréquent chez la femme. Il représente la seconde cause de décès lié à cette maladie. Ce cancer a une étiologie complexe qui serait le résultat d’une combinaison de facteurs génétiques et non génétiques. Ce mémoire s’intéresse à la composante génétique de cette maladie et plus précisément à son origine héréditaire qui représente 10% des cas de cancer du sein. Ces formes héréditaires sont dues à des mutations germinales, inactivatrices, dans des gènes suppresseurs de tumeur. BRCA1 et BRCA2 en sont les deux principaux. Les protéines qu’ils encodent jouent un rôle essentiel dans la réparation de l’ADN. La présence d’une mutation dans un de ces gènes confère un risque 10 à 20 fois plus élevé de développer cette maladie. Cependant, seulement 10 à 20 % des cas de ces cancers familiaux présentent une mutation dans un de ces gènes. Dernièrement, de nombreuses autres mutations dans des gènes suppresseurs de tumeur impliqués dans la réparation de l’ADN, la prolifération cellulaire et le métabolisme (TP53, ATM, CHEK2, RAD51C, PALB2 et LKB1) ont été mises en évidence. À ce jour, tous les gènes identifiés permettent d’expliquer au total 30% des cancers du sein héréditaires. Chez certains patients, plusieurs variantes dans des gènes différents sont trouvées. Les études qui observent ce type de résultats émettent l’hypothèse que le cancer du sein aurait une origine polygénique. Lorsqu’une origine héréditaire est suspectée dans une famille, un test génétique peut ainsi être réalisé. En routine, surtout BRCA1 et BRCA2 sont testés. La présence d’une mutation permet de l’utiliser comme outil diagnostique pour les autres membres de la famille. Les 70% des cas de cancer familiaux pour lesquels l’origine génétique reste inexpliquée ne bénéficient pas de cet outil. C’est pourquoi, ce mémoire se focalise sur l’identification de nouveaux gènes prédisposant au cancer du sein. Pour répondre à cette problématique, nous sommes partis d’échantillons d’ADN sanguin de patientes atteintes d’un cancer de sein familial et sans mutation dans BRCA1 et BRCA2. Nous avons séquencé leur exome par une technique de séquençage à haut débit. L’analyse bio-informatique des résultats nous a permis d’appliquer des filtres afin de trier les variants par cet ordre de priorité pour être à l’origine de la maladie. Nous sommes principalement focalisés sur des changements survenant dans des gènes déjà connus comme étant liés au cancer ou qui de par leur fonction pourraient jouer un rôle dans le développement du cancer. À ce jour, 127 patientes réparties sur 82 familles sont inclues dans l’étude et 48 exomes ont déjà été séquencés. Les résultats obtenus nous ont permis d’identifier un grand nombre de variants dans des gènes impliqués dans la réparation de l’ADN et certains variants dans des gènes jouant un rôle dans la prolifération cellulaire, le développement et le métabolisme. Chez de nombreux patients, plusieurs variants différents ont été identifiés, ce qui rejoint l’hypthèse de l’origine polygénique de cette maladie. Finalement, nous avons contacté d’autres membres atteints de la famille de patientes ayant un ou des variants jugés plus intéressants afin de réaliser des études de co-ségrégation. Breast cancer is the most frequent cancer and the second cause of cancer death among women. This disease has a complex etiology consisting of a combination between genetic and non-genetic factors. This master thesis focuses on the genetic part of this disease and more specifically on its hereditary origin, which represents 10 % of breast cancer cases. These hereditary forms are due to inactivated germline mutations present in tumor suppressor genes. BRAC1 and BRCA2 are the two mains ones. The proteins they encode play a major role in DNA repair mechanisms. Mutations on one of these genes confer a 10-20 fold increased lifetime breast cancer risk. However, only 10 to 20 % of family breast cancer cases have a mutation in one of these genes. Numerous other mutations in tumor suppressor genes involved in DNA repair, cell proliferation and metabolism (TP53, ATM, CHEK2, RAD51C and PALB2) have recently been discovered. All these identified genes can currently only explain 30% of the hereditary breast cancer cases. For some patients, more than one variant has been found. Studies which observe this kind of result assume that breast cancer cases might have a polygenic origin. When a hereditary origin is suspected in a family, a genetic test is performed. Routinely, mostly BRCA1 and BRCA2 are tested. The presence of a mutation can be used as a diagnostic test for the other family members. The 70 % of breast cancer family cases for which the genetic origin remains unexplained cannot benefit from this test. That is why this master thesis focuses on the identification of new predisposing genes of breast cancer. In order to identify these genes, we started with blood DNA samples from patients diagnosed with hereditary breast cancer with no mutation in BRCA1 or BRCA2.We sequenced their exomes with a high throughput sequencing technique. The bio-informatics analyses consisted of applied filters for short variants by priority orders to be at the origin of the disease. We mainly focused on variants present in genes that can play a role in cancer development. Results obtained allowed us to identify a huge number of variants in genes involved in DNA repair and some variants involved in proliferation, gene expression and metabolism. For many patients, more than one variant was identified, which corroborates the hypothesis of a polygenic origin of breast cancer. For these patients, we tried to correlate the different pathways affected and to understand their interaction. Finally, we contacted other patients’ affected family members who have interesting variants with the purpose of performing co-segregation studies.

Early Detection of Cancer --- Genes --- Breast Neoplasms --- Mutation

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Les malformations veineuses (VM) sont des défauts localisés de l'endothélium vasculaire survenant durant l'angiogenèse. Elles sont caractérisées par des canaux vasculaires délimités par une monocouche de cellules endothéliales et une couche irrégulière de cellules musculaires lisses. La plupart des VM sont sporadiques (>98%), mais elles peuvent aussi être héritées (<2%). La majorité des VM sporadiques sont causées soit par des mutations activatrices du récepteur tyrosine kinase TIE2, soit par des mutations activatrices de la PIK3CA. Précédemment, le laboratoire d'accueil a montré que la voie PI3K/AKT est le mécanisme effecteur majeur agissant en aval des mutations de TIE2. La rapamycine, un inhibiteur de mTORC1 , est efficace à réduire la croissance des VM chez l'homme et la souris. C'est la première thérapie moléculaire des VM, mais la rapamycine entraine beaucoup d'effets secondaire, ainsi nous souhaitons trouver un traitement plus spécifique et moins toxique. Nous avons testé des inhibiteurs de TIE2 et de ses cibles en aval telles que PI3K et AKT. Nous avons utilisé des cellules humaines des veines endothéliales (HUVEC) transfectées pour surexprimer TIE2-WT ou TIE2-L914F, la mutation la plus fréquente de TIE2. Pour évaluer l'efficacité de chaque inhibiteur, nous avons étudié in vitro les phénotypes connus pour être dysrégulés par les mutants de TIE2 : la phosphorylation de TIE2 et de molécules en aval, l'expression de gènes connus pour être dysrégulés, le taux de fibronectine contenue dans la matrice extracellulaire et la morphologie cellulaire. Un nouvel inhibiteur de TIE2 (confidentiel) s'avère être très efficace à restaurer ces phénotypes à ceux induits par les WT. Venous malformations (VMs) are localized defects of the vascular endothelium occurring during angiogenesis. They are characterized by enlarged channels covered by a single layer of endothelial cells and an irregular layer of smooth muscle cells. Most VMs are sporadic (>98%), but they can also be inherited (<2%). The majority of sporadic VMs are caused either by tyrosine kinase receptor TIE2 activating mutations, or by PIK3CA activating mutations. VM­ causative TIE2 mutations induce ligand-independent hyper phosphorylation of the receptor. Previously, the host lab has shown that PI3K/AKT signaling pathway is the major effector mechanism downstream of TIE2 mutations. Rapamycin, an mTORC1 inhibitor, is effective on reducing VMs growth in both human and mice. It is the first molecular therapy for VMs, but it has many side-effects, therefore we aim to find a more specific and less toxic treatment. We tested inhibitors on TIE2 and downstream molecules such as PI3K and AKT. We used Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) transfected to overexpress TIE2-WT or TIE2-L914F, the most common TIE2 mutation, to test our different treatments. To assess the efficacy of each inhibitor, we studied in vitro phenotypes known to be dysregulated by TIE2 mutant forms : cell morphology, phosphorylation of TIE2 and downstream molecules, level of ECM fibronectin and transcription levels of dysregulated genes. Surprisingly, a new TIE2 inhibitor (confidential) seems to be very effective at restoring these phenotypes to WT levels.

Endothelium, Vascular

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In the first part of this project, we studied essential hypertension, a complex disease influenced by several genetic and environmental factors. Untreated high blood pressure can lead pressure can lead to severe, life-threatening cardiovascular complications. The heritability of the trait has been estimated to 30-35%. It has been shown that different genetic variants confer an increased susceptibility to essential hypertension. Identifying these variants could lead to new preventive measures and treatments. We compared 21 SNP in 12 different genes, in a large Belgian multicentric cohort of 921 hypertensive patients and 1069 controls. We found that 4 SNP located in the locus 9p21.3 and in the genes ADAMTS15, ATP2B1 and NPPA, were strongly associated with essential hypertension risk. The locus 9p21.3 has been repeatedly associated with coronary artery disease. ADAMTS16 for a protein expressed in various tissues including the kidney, and its homolog in the mouse has been associated with hypertension. The gene ATP2BA codes for calcium ATPase , and NPPA for natriuretic peptide A. In the second part, we focused on the genetics of pheochromocytoma (PCC) and paraganglioma (PGL), rare tumors which are a cause of severe secondary hypertension for the catecholamine-secreting tumors. Their morbidity can also be due to local extension. Three genes have been implicated in syndromes associated with a higher risk of PCC or PGL : VHL, RET and NF1. In addition, mutations in the SDHx genes, coding for the 4 subunits of the succinate dehydrogenase complex, have been described. Recently, 3 new genes were discovered: TMEM127, MAX and SDHAF2. Seventy percent of our cohort has no mutation in genes SDHB, SDHC, SDHD and VHL. Therefore, screening was extended to the recently identified predisposing genes. We screened TMEM127 in 18 patients suffering from a PCC or a PGL. No pathogenic mutation was observed. MAX was also sequenced for 126 patients with a PCC or a PGL. We identified one nonsense mutation, p.Arg33*, IN 2 PCC patients. In 7 of the remaining, no staining was observed using antibodies directed against the SDHB subunit of succinate dehydrogenase. It has been shown that absence of immunohistochemical staining of SDB can be caused by a mutation in one of the SDHx genes or in rare cases in SDHAF2. Since no germline mutation was observed in the SDHx genes, we sequenced SDHAF2 in these patients. No mutation was found. We hypothesized that a somatic mutation in one of the the SDHx genes could explain the lack of expression of SDHB in these tumors. We identified three patients with a somatic deletion: 2 patients suffering from a PGL had a deletion in SDHB and one patient affected with a PCC had an SDHD deletion. Furthermore, a whole-gene deletion of SDHD was identified by multiple Ligation-dependent Probe Amplification, in 3 members of a family with an unusually severe PGL phenotype. By qPCR, we found that the deletion included all exons of SDHG as well as the two first exons of the gene translocase of inner mitochondrial membrane 8 homolog B (TIMM8B) adjacent to SDHD and encoding a mitochondrial chaperone. This finding could explain the particularly several phenotype of the family. Au cours de ce travail , nous nous sommes tout d'abord intéressés à la génétique de l 'hypertension artérielle essentielle, un trait complexe influencé par de multiples facteurs génétiques et environnementaux. Quand elle n'est pas contrôlée, l 'hypertension peut entrainer des complications cardiovasculaires majeures. Son héritabilité est estimée entre 30 et 50%. Des variations génomiques conférant une plus grande susceptibilité à l'hypertension artérielle ont été décrites. Leur identification devrait permettre de trouver de nouvelles cibles de prévention ou de traitement. Nous avons donc décidé d'étudier 21 polymorphismes associés à 12 gènes candidats dans une grande base de données multicentrique belge de 921 patients hypertendus comparés à 1069 contrôles. Après ajustement pour les multiples tests effectués, quatre SNP, situés respectivement sur le locus 9p21.3 et les gènes ADAMTS J6, ATP2Bl et NPPA, ont été associés à une susceptibilité accrue de développer une hypertension artérielle. Le locus 9p21.3 a été ssocié de manière répétée à un risque accru de coronaropathie. Le gène ADAMTSJ6 code une protéine exprimée, entre autre, dans les reins et le gène homologue chez la souris a été associé à la régulation de la pression artérielle. Le gène ATP2Bl code un transporteur calcique et, le gène NPPA le peptide natriurétique A. La seconde partie du mémoire est consacrée à la susceptibilité génétique des phéochromocytomes (PHEO) et des paragangliomes (PGL) qui constituent une cause rare d'hypertension artérielle sévère (formes sécrétantes) et/ou sont associées à une morbidité non négligeable par extension, le plus souvent, locale. Jusqu'aux années 2000, seuls trois gènes de prédisposition aux PHEO étaient décrits, essentiellement dans le cadre de syndromes : VHL, RET et NFJ . Depuis, des mutations dans les gènes SDHx, codant pour les sous-unités de la succinate déshydrogénase, ont également été rapportées dans l 0 à 20% des cas de PHEO­ PGL. Dernièrement, 3 nouveaux gènes de prédisposition ont été mis en évidence: TMEM127, MAX et SDHAF2. Suite au criblage de notre cohorte pour les gènes SDHx, plus de 70% des cas ne sont pas expliqués. Nous avons dès lors criblé les gènes récemment découverts chez ces mêmes patients. Chez 18 patients testés pour TMEM127, aucune variation pathogène n'a été observée. Le gène MAX a été criblé chez 126 patients. Une mutation p.Arg33* a été observée chez 2 patients atteints d'un PHEO surrénalien d'apparition précoce, avec récidive sur l'autre surrénale dans un des 2 cas. De plus, il a été montré qu'une disparition du marquage immunohistochimique de SDHB est due à des mutations germinales des gènes SDHB, SDHC, SDHD et, probablement SDHAF2. Sept patients de notre cohorte présentant une disparition du marquage de SDHB, en l 'absence de mutation germinale, ont été criblés pour le gène SDHAF2. Aucune mutation n'a été trouvée. Nous avons alors émis l 'hypothèse qu'une mutation somatique pourrait être présente. Nous avons identifié une perte d'hétérozygotie relative dans le gène SDHB chez 2 patients atteints d'un PGL et dans le gène SDHD chez un patient souffrant d'un PHEO. Suite à une Multiple Ligation-d ep endent Probe Amplification (MLPA) une délétion du gène SDHD avait été identifiée chez 3 membres d'une famil le souffrant d'un PGL particulièrement sévère. En réalisant des qPCR, nous avons montré que les deux premiers exons du gène de la translocase 8 de la membrane mitochondriale interne ( TIMM8B), à proximité immédiate du gène SDHD et codant une protéine chaperonne, était également délété. Ceci pourrait expliquer le phénotype particulièrement sévère de cette famille.

Hypertension, Essential --- Pheochromocytoma --- Paraganglioma

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Hemangioma --- Infant --- Child --- DNA