Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

Spherocytosis, Hereditary --- Case Management

Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

Heterotrimere G-eiwitten spelen een belangrijke rol in de signaaltransductie. In elk eiwit dat bij signaaltransductie betrokken is, kunnen spontane mutaties voorkomen die aanleiding geven tot een ziektebeeld bij de mens. De meerderheid van de mutaties treffen echter G-eiwit gekoppelde receptoren en de geassocieerde Ga-subeenheden, waaronder mutaties in Gsa het frequentst voorkomen. Mutaties in de coderende sequentie voor Gsa zowel als methylatiestoornissen in het GNAS gen werden reeds in detail bestudeerd en leiden tot ziektebeelden gekend als MAS, PHPIa, PPHP en PHPIb. Dit werk toonde echter aan dat niet bij alle patiënten met een gestoorde signaaltransductie via Gs een mutatie in Gsa gevonden kan worden: kinderen met een idiopathische kleine gestalte vertoonden een hypofunctie van Gs in de bloedplaatjes, maar toch kon het klinische beeld niet verklaard worden door een mutatie in Gsa, noch in een ander transcript van de GNAS cluster. Deze bevindingen suggereren dat andere genen en eiwitten indirect de signaaltransductie via Gs kunnen beïnvloeden en hierdoor een klinisch fenotype veroorzaken dat kan passen bij een genetisch defect in het GNAS gen. Eerst en vooral zijn RGS-eiwitten voor de hand liggende kandidaten, aangezien zij de signaaltransductie via G-eiwitten per definitie modifiëren door middel van hun GTPase-activiteit. Daarnaast zijn G-eiwitten in het cytoskelet gelokaliseerd waardoor er een bidirectionele interactie plaatsvindt tussen G-eiwitten en cytoskeleteiwitten zoals actine, dystrofine en tubuline. Op die manier kunnen structurele eiwitten ook de signaaltransductie via G-eiwitten modifiëren. In deze studie onderzochten we hoe mutaties in het dystrofinegen aanleiding konden geven tot dysfunctie van de signaaltransductie via Gs. Patiënten met DMD vertonen wel tijdens heelkunde een bloedingsprobleem maar geen spontane bloedingsneiging, wat kenmerkend is voor Gs-gerelateerde pathologie. Aangezien bloedplaatjes makkelijk bereikbare “cellen” zijn, bestudeerden we de bloedplaatjesfunctie bij deze patiënten en stelden we een intrinsiek Gs-gekoppelde bloedplaatjesdysfunctie vast. Deze Gs hyperfunctie is het onmiddellijke gevolg van een dysfunctionele dystrofine isovorm in het cytoskelet van de bloedplaatjes. We bevestigden deze Gs hyperfunctie ook in fibroblasten van de patiënten met DMD. Als gevolg van een slecht georganiseerd cytoskelet vertonen deze patiënten een verhoogde expressie van Gsa en daardoor een induceerbare Gs hyperfunctie. Hierdoor kunnen natuurlijke Gs agonisten die vrijkomen bij heelkunde een verhoogd bloedverlies veroorzaken tijdens spinale chirurgie. Bovendien resulteert het verstoorde cytoskelet in DMD bloedplaatjes in een verminderd antwoord op collageen, wat de bloedplaatjesdysfunctie nog versterkt. De impact op bloedplaatjesfunctie en op andere fysiologische processen door genen die de signaaltransductie via G-eiwitten indirect beïnvloeden, alsook hun rol in ziektebeelden bij de mens is echter vaak ongekend. Daarom ontwikkelden we een in vitro en in vivo model waarmee we murine embryonale stamcellen kunnen differentiëren naar megakaryocyten en bloedplaatjes. Door genetisch gemanipuleerde embryonale stamcellen te differentiëren zullen deze modellen ons helpen de impact op megakaryopoïese en bloedplaatjesfunctie door dergelijke modifiërende genen in het licht te stellen en hun rol in pathologieën bij de mens af te leiden. RGS18 zou hiervoor als model gen gebruikt kunnen worden. Vroegere studies hebben al gesuggereerd dat RGS18 een rol speelt in de maturatie van megakaryocyten. Hier toonden we aan dat RGS18 de signaaltransductie via Gs in een humane megakaryocyten cellijn beïnvloedt. Bovendien konden we een rol voor RGS18 in megakaryopoïese aantonen, doordat overexpressie van rgs18 in stamcellen afkomstig van navelstrengbloed de differentiatie naar megakaryocyten bevorderde. We kunnen hierom besluiten dat genetische manipulatie van het rgs18 gen in murine embryonale stamcellen ons kan helpen het in vivo belang van dit eiwit in megakaryocyten en bloedplaatjesfunctie en mogelijks ook in andere (patho)fysiologische processen in het licht te stellen. Heterotrimeric G-proteins are important participants in signal transduction cascades by which a cell responds to signals from its environment. All proteins involved in signal transduction may be targets for naturally occurring mutations resulting in human diseases but the great majority of mutations involve GPCRs and their coupled Ga-subunits of which mutations in Gsa are the most frequent. Mutations in the coding sequence of Gsa and methylation defects in the GNAS cluster have been studied in detail and result in disorders, such as MAS, PHPIa, PPHP and PHPIb. This work however demonstrated that not all patients with Gs pathway dysfunction carry a mutation in Gsa. Children with idiopathic short stature exhibited platelet Gs pathway hypofunction, but their clinical picture could not be explained by a mutation in any of the transcripts generated by the GNAS gene. Hence, other genes and proteins presumably interfere with the Gs pathway, resulting in a clinical phenotype similar to that associated with a genetic defect in the GNAS cluster. RGS-proteins are obvious candidates, as they modify G-protein signalling through GTPase-activity. Nevertheless, G-proteins are localized to the cytoskeleton, resulting in a bidirectional interaction between the G-protein and cytoskeletal proteins, such as actin, dystrophin and tubulin. Thus, structural proteins could also be possible modifiers. In this study, we explored how mutations in the dystrophin gene lead to Gs dysfunction. Patients with DMD present with a surgery-related bleeding problem without a spontaneous bleeding tendency, which is characteristic for Gs-related pathology. Since platelets are easily accessible patient-derived “cells” to study Gs function, we investigated platelet function in these patients. They indeed showed an intrinsic Gs-coupled platelet dysfunction, as a direct result of a dysfunctional dystrophin isoform in the platelet cytoskeleton. We confirmed the existence of a dysfunctional Gs pathway in fibroblasts from patients with DMD. Due to the disorganized dystrophin-containing cytoskeleton, patients with DMD have significantly enhanced Gsa expression and an inducible Gs hyperfunction, whereby natural Gs agonists released during surgery increase platelet Gs activity, leading to increased blood loss during spinal surgery. In addition, the cytoskeleton disorganization in platelets from patients with DMD results in a decreased collagen response, enhancing platelet dysfunction. The impact of candidate modifiers on platelet function or other physiological processes and their role in human pathologies is often unknown. Hence, we set up an in vitro and in vivo model enabling us to differentiate murine embryonic stem cells into megakaryocytes and platelets. By differentiation of genetically modified embryonic stem cells, these models should help to unravel the importance of RGS-proteins and other candidate modifiers of the Gs pathway in megakaryopoiesis and platelet function and to further deduce their role in human diseases. In a first step, RGS18 could function as a model gene for interference with G-protein signalling by RGS-proteins. Previous studies have already suggested a role for RGS18 in the maturation of megakaryocytes. Here we demonstrated that rgs18 indeed influences Gs function in a human megakaryocytic cell line. Moreover, overexpression of rgs18 in human cord blood cells showed that it is implicated in megakaryopoiesis too, as megakaryocytic differentiation was enhanced. Therefore, we conclude that genetic modification of the rgs18 gene in murine embryonic stem cells should help to unravel the importance of this protein in  in vivo megakaryopoiesis and platelet function and hopefully also in other (patho)physiological processes. G-eiwitten spelen een belangrijke rol in signaaltransductie, waardoor een cel met zijn omgeving communiceert. Op elk niveau van deze cascade van signalen kunnen mutaties optreden die aanleiding geven tot ziektebeelden bij de mens, maar meestal komen dergelijke mutaties voor in de receptor zelf of in de a-subeenheid van een G-eiwit. Mutaties in de a-subeenheid van het stimulerende G-eiwit, Gsa, komen het frequentst voor en werden reeds beschreven in goed gekende ziektebeelden. Hier bestudeerden we echter kinderen met een kleine gestalte en een gestoorde signaaltransductie via Gs, bij wie geen mutatie kon aangetoond worden in het gen voor Gsa, namelijk het GNAS gen. Dit suggereert dat andere genen en eiwitten indirect de signaaltransductie via Gs kunnen beïnvloeden en hierdoor een klinisch beeld veroorzaken dat kan passen bij een genetisch defect in het GNAS gen zelf. In het vervolg van deze studie bestudeerden we 2 dergelijke kandidaatgenen. In de eerste plaats ging onze aandacht naar jongens met de ziekte van Duchenne. Ten gevolge van een mutatie in het gen voor een structureel eiwit (namelijk dystrofine) vertonen deze patiënten een bloedingsprobleem bij heelkunde, maar geen spontane bloedingsneiging. Dit klinisch beeld is kenmerkend voor een gestoorde signaaltransductie via Gs en verdere investigaties in bloedplaatjes van deze patiënten maakten inderdaad duidelijk dat een te sterke signaaltransductie via Gs in deze patiënten het directe gevolg was van een verstoord structureel eiwit. In het laatste deel van de thesis toonden we tenslotte aan dat ook een RGS-eiwit, namelijk RGS18, de signaaltransductie via Gs kan beïnvloeden en de maturatie van megakaryocyten in cultuur stimuleert. Verdere studies om deze bevindingen in diermodellen te bevestigen, moeten nu volgen. Hiervoor werd reeds een diermodel op basis van transplantatie van gedifferentieerde embryonale stamcellen uitgewerkt.