Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

Purpose: Due to molecular testing in the context of targeted therapy rare mutations are found. Here we described two types of mutations in NSCLC, namely an EGFR exon 19 insertion and different kind of MET mutations. First, we examined if EGFR exon 19 insertion mutations may benefit from EGFR Tyrosine kinase inhibitors (TKIs). Next, we investigated, in the group of samples that harboured a MET alteration, if there is a relation between MET gene copy number (GCN) and c-MET protein and if immunohistochemistry (IHC) can be used to screen for MET exon 14 (METex14) skipping mutations. Lastly, we described the response of patients with a METex14 skipping mutation to MET TKIs. Patients and methods: Samples that underwent Next-Generation Sequencing (NGS) from April 2016 until August 2017 were reviewed. Furthermore, one supplementary sample with a METex14 skipping mutation, discovered in September 2017 at UZLeuven, was added to the MET study. C-MET IHC and Silver in situ hybridisation (SISH) were performed to evaluate c-MET protein expression and MET GCN, and their inter-correlation. A total of 36 samples were analysed using literature or we performed NGS on a blood sample of the patient to see if the found mutations were oncogenic drivers or not. Results: One patient was found to harbour an EGFR exon 19 insertion mutation. She was given Iressa as second line therapy. After 5 and 11 months of therapy we obtained a partial response. MET alterations were found in 36 samples. C-MET IHC was positive in 100% of 29 samples. Met amplification occurred in 8,7% and MET GCN > 5 in 17% of 23 samples. C-MET IHC and MET gene amplification were not significantly associated with tumour stage. There was no significant association between c-MET IHC and MET SISH. METex14 skipping prevailed in 11 of 534 samples (2,06%). This occurred mostly in adenocarcinomas. Yet we found 2 squamous cell carcinomas with a METex14 skipping mutation. Patients treated with MET TKs showed a stable disease or partial response. Conclusion: Our patient with an EGFR exon 19 insertion obtained a partial response after 5 and 11 months of Iressa, which suggests benefit from EGFR TKIs. Further follow-up is needed to see the long-term response. MET amplification prevailed in 2.06% of our samples. We found no correlation between c- MET IHC and MET SISH in our study population. We suggest that c-MET IHC cannot be used to detect METex14 skipping mutations, due to the overall high staining in all our samples. Still further examination is required with an optimized staining protocol. Lastly, we showed that patients with METex14 skipping can obtain a stable disease or partial response with MET TKIs. Still further follow-up is needed to study the long-term prognosis.

Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

Postmortem microbiological examination can be used for confirmation of an infectious death or identification of the causative microorganism. Problems of implementing routine sampling procedures clearly relate to the lack of consensus on their broader utility and to a lack of regulatory guidelines. The aim of this study is to evaluate relevance as well as site-, time-, and technique related aspects of postmortem microbiology. A single center prospective study is performed from 2013 to 2016 at University Hospitals Leuven including forensic and clinical autopsies. Routine autopsy, separating infectious and non-infectious deaths, and microbiological sampling on 7 sampling sites throughout the body are performed. 200 autopsies (with 1321 samples) are included of which nearly 1/5 have an infectious cause of death, mainly pneumonias. Why? The general rule is confirmed: a single isolate of a known pathogen can be regarded as possible genuine positive even in the absence of clinical or pathological corroboration. If the isolate is associated with some corroborative evidence of inflammation, it can be accepted as likely genuine positive. A list of ‘‘true pathogens’’ is nearly impossible to compile. Where? Sampling at least internal or external peripheral blood or heart blood, (preferably the left) lung and spleen is recommended. The more positive sampling sites, the higher the risk of an infectious death. When? In forensic cases instant cooling and limited mobilization is seldom possible. Postmortem interval remains a confounding factor. By whom? Sampling should be performed by an educated and experienced pathologist as part of a protocol.

Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

Spinocellulaire hoofd-en halscarcinomen (SCCHH) zijn de zesde meest voorkomende niet-hematologische maligniteiten met een incidentie van meer dan 600.000 patiënten per jaar. Ondanks recent doorgevoerde optimalizaties van de drie bestaande behandelingspijlers chirurgie, chemotherapie en radiotherapie blijven SCCHH een belangrijke oorzaak van kanker- en therapie-gerelateerde morbiditeit en mortaliteit. Het invoeren van nieuwe behandelingsmogelijkheden, of het op punt stellen van de bestaande opties, zou theoretisch gezien de prognose van deze patiëntengroep kunnen verbeteren. Moleculaire biomerkers kunnen dan helpen om patiënten te selecteren voor specifieke, op maat gerichte behandelingsschema’s. Het huidige werk beoogde voornamelijk te onderzoeken of bepaalde eigenschappen van de tumor en zijn micro-omgeving kunnen fungeren als biomerker. Wat betreft de micro-omgeving richtte het onderzoek zich op hypoxie of zuurstoftekort. Daarnaast werden microsatelliet alteraties (microsatelliet instabiliteit (MSI) en verlies van heterozygositeit (LOH)) geanalyseerd als voorbeelden van genetische alteraties, terwijl het fenomeen van promoter hypermethylatie werd bestudeerd als prototype van epigenetische alteraties. Hypoxie Gezien de aanwezigheid van hypoxie de tumorcontrole negatief beïnvloedt, werd in eerste instantie de prognostische waarde van een reeks hypoxie-gerelateerde merkers geëvalueerd. In het verleden publiceerde onze groep een studie waarin voor een groep van 105 patienten met gevorderde SCCHH werd aangetoond dat een lage tumor perfusie, bepaald door middel van een perfusie-CT, correleerde met een slechte locale controle. De hypothese dat deze beeldvormingstechniek kon fungeren als surrogaat merker voor hypoxie werd door ons nagegaan op moleculair niveau door gebruik te maken van twee subgroepen. In een eerste subgroep van 67 patienten werden pretherapeutische tumor biopten immuunhistochemisch gekleurd voor CA IX en voor GLUT-1. In een tweede subgroep van 34 patiënten werden pretherapeutische serum waarden van IL-6 en VEGF bepaald door middel van ELISA. Er werd nagegaan of er een verband bestond tussen tumor perfusie en elk van deze biologische merkers, alsook tussen de merkers onderling. Daarnaast werd de prognostische waarde van deze micro-omgevingsparameters onderzocht. De bevinding dat de klassieke clinicopathologische parameters zoals leeftijd en tumor stadium de prognose significant beïnvloedden, ondersteunde de representativiteit van de subgroepen. In de eerste subgroep werd er een zwak negatief verband waargenomen tussen CT-bepaalde tumor perfusie en pretherapeutische VEGF serum waarden (R=-0.32, p=0.06). Daarnaast bleek een gecombineerde hoge expressie van CA IX en GLUT-1 een negatieve prognostische factor (locale controle: p=0.03; regionale controle: p=0.02; ziekte-vrije overleving: p=0.02). In de tweede subgroep werd vastgesteld dat IL-6 waarden boven de mediaan de enige onafhankelijke predictor waren voor slechtere locale controle (p=0.009), ziekte-vrije overleving (p=0.02) en totale overleving (p=0.005). Daarmee was deze studie de eerste waarin een klinisch verband werd aangetoond tussen pretherapeutische IL-6 serum waarden en radioresistentie in SCCHH. Microsatelliet alteraties Gezien hypoxie selecteert voor genetisch instabiele tumoren werden, met behulp van microsatelliet merkers, MSI en LOH bestudeerd als voorbeelden van genetische alteraties in SCCHH. Dit onderzoek gebeurde in optimale omstandigheden door gebruik te maken van automatische fragmentanalyse gebaseerd op fluorescent-gemerkte primers. In totaal werden 20 microsatelliet merkers gebruikt, zowel bestaande uit merkers behorende tot het NCI referentie panel als uit merkers waarvan in voorgaande publicaties werd beweerd dat ze MSI (en in mindere mate LOH) zouden kunnen opsporen in SCCHH. In het kader van ons tweede doel om een verband tussen MSI/LOH en hypoxie te onderzoeken, werden 48 patiënten met gevorderde SCCHH behandeld met chirurgie +/- radiotherapie onderzocht. MSI en LOH werden geëvalueerd aan de hand van de beide panels. De aanwezigheid van hypoxie in de tumor micro-omgeving werd bestudeerd door middel van immunohistochemie voor pimonidazole als extrinsieke hypoxie merker, en voor CA IX en GLUT-1 als mogelijke intrinsieke hypoxie merkers. Geen enkele patiënt vertoonde MSI. LOH daarentegen werd wel waargenomen, en was in overeenstemming met de literatuur het meest aanwezig op de chromosoom armen 3p, 5q, 9p, 17p en 17q. De hypothese dat hypoxie zou selecteren voor microsatelliet alteraties werd slechts deels bevestigd door het positieve verband tussen LOH op D17S799, dat zich bevindt in de omgeving van p53, en CA IX expressie in het pretherapeutische tumor biopt (p=0.01). Ondanks de beperkte grootte van deze heterogeen behandelde patiëntengroep werd de prognostische waarde van de onderzochte biomerkers geëvalueerd. Deze analyses toonden een negatieve prognostische rol voor LOH op bepaalde loci en in mindere mate voor globale LOH voor wat betreft locale controle, totale overleving en ziekte-vrije overleving. Gezien de controverse rond het voorkomen van MSI in SCCHH, werd tot derde doel gesteld de prevalentie van MSI te bepalen in een groep van 80 patiënten met gevorderde SCCHH. Hiervoor werd dezelfde set van 20 microsatelliet merkers geëvalueerd door middel van automatische fragment analyse. De studie resulteerde in slechts één MSI-positieve tumor, die voor beide panels MSI-High toonde (8/10 positieve merkers in het NCI reference panel en 6/10 positieve merkers in het SCCHH panel). Kwalitatief gezien kon de geobserveerde MSI geclassificeerd worden als Type B MSI. Deze resultaten suggereren dat MSI een lage prevalentie heeft in SCCHH en dat MMR defecten waarschijnlijk geen groot belang hebben in het ontstaansproces van deze tumoren. Epigenetische alteraties Naast genetische alteraties, worden epigenetische alteraties intensief bestudeerd in het kader van hun tumor merker potentieel. In het laatste gedeelte van dit werk werd de invloed van epigenetische veranderingen op de radiogevoeligheid van SCCHH onderzocht. Terwijl hierbij de nadruk lag op promoter hypermethylatie werden ook histon modificaties bestudeerd. Overeenkomstig vroegere en huidige studies rond de enkelvoudige en gecombineerde activiteit van demethylerende agentia en histon deacetylatie inhibitoren (HDAC-I), werd als vierde doel het potentieel van deze medicaties als radiosensitizers in SCCHH nagegaan. De radiosensitizerende eigenschappen van het demethylerend agens 5-aza-2’-deoxycytidine (DAC), al dan niet in combinatie met lage dosissen van de HDAC-I Trichostatine A (TSA), LBH589 en MGCD0103, werden onderzocht in SCCHH cellijnen. Meer concreet werden colony assay experimenten uitgevoerd, gebruik makende van medicatiedosissen met een gekend effect op celoverleving en proliferatie. Om de moleculaire activiteit na te gaan werd de acetylatie status van de histonen bestudeerd. Daarnaast werd de invloed van de epigenetische drugs op de expressie van epigenetisch uitgeschakelde genen bekeken op DNA, RNA en proteïne-niveau. Tenslotte werd het werkingsmechanisme voor de geobserveerde radiosensitizatie verder uitgeklaard door evaluaties van het effect op apoptose, celcyclus en γH2AX vorming. In twee van de vier onderzochte cellijnen werd radiosensitizatie waargenomen na behandeling met niet-cytotoxische dosissen DAC+/-HDAC-I, vooral voor de combinaties van DAC met LBH589 en MGCD0103. De radiosensitizerende medicatiedosissen bleken in wisselende mate histon hyperacetylatie te induceren en de epigenetische transcriptionele uitschakeling te herstellen. Daarnaast versterkten ze het door de radiotherapie geïnduceerde G2/M celcyclus arrest. Binnen de zoektocht naar nieuwe moleculaire merkers die het antwoord van SCCHH op radiotherapie kunnen voorspellen, werd tot slot van dit werk promoter hypermethylatie bestudeerd als epigenetische tumor merker in SCCHH. Epigenetische transcriptionele repressie van TIMP3, CDH1, DAPK, RASSF1A, p16INK4A en MGMT werd nagegaan door middel van methylatie-specifieke PCR in een groep van 46 patiënten met gevorderde hoofd-en halskanker. Deze patiënten werden allen behandeld met hetzelfde schema van gecombineerde geaccelereerde fractionatie radiotherapie, zoals dat recent door ons centrum werd beschreven. Er werd een verband onderzocht tussen de promoter hypermethylatie die werd teruggevonden in de pretherapeutische tumor biopten, en het ziekteverloop van de patiënten. In de tumor biopsies werd methylatie vastgesteld van MGMT in 42.5% (17 op 40) en van TIMP3 in 40.5% (17 op 42) van de tumoren. Voor de andere onderzochte genen werden lagere percentages van epigenetische uitschakeling vastgesteld: 13.2% (5 op 38) voor CDH1, 11.4% (5 op 44) voor DAPK, 4.8% (2 op 42) voor p16INK4A en 2.4% (1 op 41) voor RASSF1A. De clinicopathologische factoren waarvan wordt aangenomen dat deze relevant zijn voor de prognose van SCCHH bleken ook in deze patiëntengroep significant, wat de representativiteit ondersteunt. Promoter hypermethylatie van TIMP3 en CDH1 waren significant geassocieerd met een betere locoregionale controle (respectievelijk p=0.009 en p=0.02), totale overleving (respectievelijk p=0.005 en p=0.002), ziektevrije overleving (respectievelijk p=0.02 en p=0.004) en ziekte-specifieke overleving (respectievelijk p=0.12 en p=0.007). Algemene conclusie Van alle biomerkers die in dit werk bestudeerd werden, is promoter hypermethylatie momenteel het meest onderzochte fenomeen met tegelijk het meeste potentieel in SCCHH. Bovendien hebben epigenetische drugs tot hiertoe veelbelovende resultaten opgeleverd zowel in enkelvoudige als in gecombineerde schema’s. Voor definitieve conclusies omtrent hun klinische toepasbaarheid dienen echter lange-termijn gegevens te worden afgewacht. SCCHH blijft, ondanks de enorme inspanningen in het kankeronderzoek, een belangrijke oorzaak van morbiditeit en mortaliteit. Op lange termijn zal de behandeling van kanker waarschijnlijk evolueren naar een geïndividualiseerde multi-modaliteitsbehandeling gebaseerd op combinaties van meerdere merkers. Head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) is the sixth most common solid tumor with an incidence of more than 600,000 patients annually. Despite recent optimizations in the three traditional pillars surgery, chemotherapy and radiotherapy, this malignancy stays an important cause of disease- and therapy-related morbidity and death. Theoretically, patient outcome may be improved by implementing new treatment strategies or optimizing the existing ones. Importantly, the search for molecular biomarkers may aid in the stratification of patients to particular treatment protocols, resulting in individually adapted therapies. The present work primarily aimed to assess the biomarker potential of characteristics of both the tumor itself and its microenvironment in HNSCC, with emphasis on the radiotherapy setting. Concerning the microenvironment, the project focused on hypoxia. Microsatellite alterations (microsatellite instability (MSI)/loss of heterozygosity (LOH)) were analyzed as examples of genetic alterations, while promoter hypermethylation was studied as prototype of epigenetic alterations. Hypoxia Given the proven negative impact of hypoxia on tumor control, the first aim of our work was to investigate the prognostic value of a set of hypoxia-related markers. In a previous study of 105 patients with advanced HNSCC treated by radiotherapy +/- chemotherapy a low tumor perfusion as measured by perfusion-CT correlated with poor local control, suggesting this imaging technique could serve as a surrogate marker for hypoxia. To investigate this hypothesis at the molecular level, two subgroups were investigated in the current study. Immunohistochemistry for CA IX and GLUT-1 was performed on pretherapeutic tumor biopsies of a first subgroup of 67 patients, and VEGF and IL-6 pretreatment serum levels were determined in a second subgroup of 34 patients. Correlation was investigated between tumor perfusion and each of these biological markers, as well as between the markers mutually. The prognostic value of these microenvironmental parameters was also evaluated. The classical clinicopathological parameters such as age and tumor stage significantly influenced patient outcome, affirming the representativeness of these subgroups. In the first subgroup, a weak negative correlation was revealed between CT-determined tumor perfusion and pretreatment VEGF serum levels (R=-0.32, p=0.06). Combined high expression levels of CA IX and GLUT-1 correlated independently with poor prognosis (local control: p=0.03; regional control: p=0.02; disease-free survival: p=0.02), suggesting the preferable use of combined approaches in the investigation of hypoxia markers. In the second subgroup, IL-6 pretreatment serum levels above the median were the only independent predictor of poor local control (p=0.009), disease-free survival (p=0.02) and overall survival (p=0.005), being the first study to report a link in HNSCC between IL-6 pretreatment levels and radioresistance in vivo. Microsatellite alterations Since hypoxia is known to select for genetically unstable tumors, MSI and LOH were investigated as examples of genetic alterations in HNSCC using microsatellite markers. MSI and LOH were tested in optimal conditions, using fluorescent-labeled primers to make automatic fragment analysis possible. A group of 20 microsatellite markers was used, consisting both of markers from the NCI reference panel, and of markers suggested to reveal MSI (and to a lesser extent LOH) in HNSCC by previous reports. According to our second aim to investigate a relationship between MSI/LOH and hypoxia, 48 patients with advanced HNSCC treated by surgery +/- radiotherapy were studied. MSI and LOH were assessed with the two panels. The presence of hypoxia in the tumor microenvironment was determined with immunohistochemistry for pimonidazole as an extrinsic hypoxia marker, and for CA IX and GLUT-1 as possible intrinsic hypoxia markers. This study revealed no patient with MSI. In accordance with literature, highest LOH percentages were found on chromosomal arms 3p, 5q, 9p, 17p and 17q. The hypothesis that hypoxia could select for microsatellite alterations was only partly confirmed by a positive correlation between LOH at D17S799, located near p53, and the CA IX expression level in the pretherapeutic tumor biopsy (p=0.01). Taking into account the small size of this heterogeneously treated patient group, the prognostic value of the investigated biomarkers was evaluated and revealed a negative prognostic role for LOH at certain loci and to a lesser extent for global LOH towards local control, overall survival and disease-free survival. As it is still unclear whether true MSI exists in HNSCC, our third aim was to determine the prevalence of MSI in a group of 80 patients with advanced stage HNSCC. This was done by automatic fragment analysis using the same set of twenty microsatellite markers. This study revealed only one MSI-positive tumor, in which both panels showed MSI-High (8/10 positive markers for the NCI reference panel and 6/10 positive markers for the HNSCC panel). Qualitatively, the observed MSI could be classified as Type B MSI. These data indicate that the prevalence of MSI in HNSCC is low and that MMR deficiency contributes little to the carcinogenetic process in this disease. Epigenetic alterations Next to genetic alterations, epigenetic modifications have been studied intensively for their potential to act as tumor markers. The last part of this work investigated the influence of epigenetic events on radiosensitivity of HNSCC. While the main focus was on promoter hypermethylation, histone modifications were also studied given the established cooperation between these two epigenetic processes. In alignment with previous and ongoing studies investigating the single and combined activity of demethylating agents and histone deacetylase inhibitors (HDAC-I), we focused on their potential role as radiosensitizers in HNSCC as our fourth aim. The radiosensitizing potential of the demethylating agent 5-aza-2’-deoxycytidine (DAC) in combination with low doses of the HDAC-I Trichostatin A (TSA), LBH589 and MGCD0103 was assessed in HNSCC in vitro. In four HNSCC cell lines, colony assays were performed using drug doses with an established effect of cell survival and proliferation. To investigate the molecular activity, histone acetylation status and expression of epigenetically silenced genes at the DNA, RNA and protein level was assessed. Further exploration of the radiosensitizing working mechanism was done by evaluating the effect on apoptosis, cell cycle and γH2AX formation. Radiosensitization was observed in two HNSCC cell lines after treatment with non-cytotoxic doses of DAC+/-HDAC-I, especially for combinations of DAC with LBH589 and MGCD0103. The radiosensitizing doses induced histone hyperacetylation and reversal of gene silencing to variable extents and increased radiation-induced cell-cycle arrest. In the context of the search for new molecular markers which can predict response of HNSCC patients to radiotherapy, the last part of our work aimed to explore promoter hypermethylation as prognostic or predictive tumor marker in this cancer type. Epigenetic silencing of TIMP3, CDH1, DAPK, RASSF1A, p16INK4A and MGMT was assessed by methylation-specific PCR in a group of 46 patients with advanced HNSCC, who were treated by hybrid accelerated fractionation radiotherapy as published recently by our group. The epigenetic silencing detected in the pretreatment paraffin-embedded tumor biopsies was related with outcome. The tumor biopsies