Listing 1 - 2 of 2 |
Sort by
|
Choose an application
Choose an application
Voor gistcellen zijn de kwaliteit en de hoeveelheid van de beschikbare nutriënten essentiële regulatoren van groei en ontwikkeling. Wanneer gistcellen zich in een medium bevinden waarin een koolstof-, stikstof-, fosfor-, of zwavelbron ontbreekt, zullen ze stoppen met groeien en in stationaire fase gaan. Deze cellen hebben een sterk verhoogde stressresistentie, en kunnen daardoor onder deze nadelige omstandigheden overleven. Aan de andere kant, brengen deze cellen ook een hele reeks nutriëntsensoren en bijhorende signaaltransductiewegen tot expressie. Indien de ontbrekende nutriënten opnieuw beschikbaar worden, zullen de cellen hierdoor direct kunnen reageren, wat ertoe leidt dat de karakteristieke stationaire fase fenotypes weer verdwijnen, en de cellen opnieuw beginnen te groeien. In dit verband is geweten dat het toedienen van de stikstofbron ammonium, aan stikstof-gedepriveerde, glucose-gerepresseerde cellen, een snelle activatie van de zogenaamde FGM signaalweg induceert. Deze ammonium-geïnduceerde activatie van de FGM signalering vereist ammonium opname door de ammonium permeasen Mep1 of Mep2. Tijdens dit onderzoek hebben we echter gevonden dat passieve diffusie van ammonium, of zijn structureel analoog methylammonium, doorheen de plasmamembraan van mep1∆ mep2∆ mep3∆ cellen, evenzeer voor een duidelijke FGM-respons zorgt. Dit duidt er dus op dat ammonium en MA in de cel kunnen gedetecteerd worden, onafhankelijk van de Mep proteines. Voor deze respons was metabolisering van ammonium naar glutamaat of glutamine niet nodig. De overgrote meerderheid van de NH3 of CH3-NH2 molecules die door diffusie in de cel terechtkomen, zullen in het cytoplasma geprotoneerd worden en dus voor een stijging van de cytosolische pH zorgen. Deze intracellulaire alkalinizatie kon m.b.v. een pH-gevoelig mutant GFP allel gekwantificeerd worden. De MA-geïnduceerde alkalinizatie kon stapsgewijs tegengegaan worden door toevoegen van stijgende hoeveelheden van het zwakke zuur sorbinezuur. Onder deze omstandigheden werd er telkens een zeer hoge MA accumulatie in de cel gemeten. Anderzijds werd er een stapsgewijze verlaging van de trehalase-activatie waargenomen, gecorreleerd aan de verlaging van de intracellulaire alkalinizatie. Dit duidt er sterk op dat de Mep-onafhankelijke ammonium- of MA-sensing eigenlijk veroorzaakt wordt door een stijging van de intracellulaire pH en niet door een directe intracellulaire detectie van deze moleculen. Dit resultaat duidde er verder mogelijk op dat Mep2, naar analogie met de EcAmtB ammoniumtransporter, NH3 over de plasmamembraan transporteert, en dat de alkalinizatie die hiervan het gevolg is, zorgt voor de eigenlijke activatie van FGM signalering door Mep2. Na toevoegen van ammonium of MA aan een mep1∆ MEP2 mep3∆ stam kon echter geen pH-stijging gemeten worden. Sterker nog, in cellen waar de pH met één pH eenheid verlaagd werd door toevoegen van sorbinezuur, kon nog steeds een duidelijke MA-geïnduceerde trehalase-activatie gemeten worden. Dit toont duidelijk aan dat de Mep2-gemedieerde activatie van trehalase na toevoegen van MA niet door een alkalinizatie van het cytoplasma kan veroorzaakt worden, en naar analogie geldt hetzelfde voor ammonium als substraat. Dit experiment geeft sterke argumenten dat Mep2 zelf als een ammoniumsensor fungeert bij de activatie van de FGM signaalweg. Verder geeft dit experiment aan dat Mep2 NH4+ over de membraan transporteert. Om de transport- en sensingfunctie van Mep2 te onderzoeken, werd er een reeks mutanten aangemaakt. De gemuteerde residu’s lagen allemaal in regio’s van Mep2 die blootgesteld zijn aan het cytoplasma. We hebben gevonden dat in de meerderheid van de mutanten, transport en sensing sterk gekoppeld waren. Dit betekent dat mutanten met een verlaagd transport, meestal een vergelijkbare verlaging van de trehalase-activatie hadden. Dit wijst erop dat een conformatieverandering die samengaat met het transporteren van ammonium of MA van het periplasma naar het cytoplasma, ervoor zorgt dat de FGM signalering gestimuleerd wordt. Langs de andere kant konden er ook mutanten gevonden worden met een gedeeltelijke ontkoppeling tussen transport en signalering. In de Mep2D279AY280G, Mep2D279A, Mep2Y280R en Mep2K60AH61G mutanten, was de trehalase-activatie na toevoeging van ammonium en/of MA in veel sterkere mate verlaagd dan het transport en de intracellulaire accumulatie van deze substraten. Deze resultaten zijn tegenstrijdig met een intracellulair detectiemechanisme van ammonium of MA, en geven verdere argumenten voor een rol voor Mep2 als sensor van deze moleculen. In andere onderzoeksgroepen is er reeds aangetoond dat Mep2 ook een rol heeft als sensor voor de inductie van pseudohyfale groei onder condities van ammoniumlimitatie. Gebruik makende van onze collectie van Mep2 mutanten, konden we aantonen dat de rol die Mep2 heeft als sensor na toevoegen van ammonium aan stikstofgedepriveerde cellen, niet overeenkomt met zijn rol als sensor voor de inductie van filamentatie bij ammoniumlimitatie. We konden tijdens dit onderzoek ook aantonen dat PKA en Sch9, twee componenten waarvan geweten is dat ze vereist zijn voor aminozuursignalering, ook noodzakelijk zijn voor de ammonium-geïnduceerde FGM signalering. Verder hebben we nieuwe componenten van de FGM signaalweg, die stroomafwaarts van de Mep2 ammoniumsensor ligt, proberen te identificeren. Hiervoor werd een screeningsmethode ontwikkeld waarmee we mutanten hebben kunnen isoleren die geaffecteerd zijn in de ammonium-geïnduceerde signaaltransductie. Gebruik makende van een collectie van transposon-gemutagenizeerde gist-mutanten, konden we 8 mutanten isoleren met een defect in ammoniumsignalering. In deze mutanten bleken de CYR1, CDC25, PRR2 of de RSN1 genen door een transposon-insertie verstoord te zijn. Voor Prr2 en Rsn1 werd aangetoond dat ze niet betrokken zijn in ammoniumsignalering terwijl Cyr1 en Cdc25 waarschijnlijk ook geen rechtstreekse rol hebben in deze respons. Tenslotte werd er nog een screening uitgevoerd om proteinen te identificeren die specifiek met Mep2 interageren. Hiervoor maakten we gebruik van de zogenaamde split-ubiquitin methode, en konden we 26 proteinen identificeren die vermoedelijk met Mep2 interageren. Van een aantal van deze kandidaten, werd de overeenkomstige deletiemutant reeds getest voor [14C]MA opname en ammonium-geïnduceerde trehalase-activatie. De meeste mutanten waren echter nauwelijks geaffecteerd in deze eigenschappen. Enkel de ssb2∆ mutant had een significant verlaagde activatie van trehalase na toedienen van ammonium, alhoewel deze respons alleen gezien werd in de ssb2∆ mutant van de BY4741 achtergrond en niet in de ∑1278b achtergrond. For yeast cells, the quality and abundance of nutrients are among the most important regulators of growth and development. Yeast cells that are starved for an essential nutrient, like a carbon, nitrogen, phosphor or sulphur source, stop growing and enter stationary phase. These cells have a strongly increased general stress resistance, which allows them to survive this adverse condition. On the other hand, stationary phase cells are also equipped with nutrient sensors and signal transduction pathways that continuously scan the environment, and induce a broad range response leading to a reversion of the stationary phase phenotypes and a resumption of cellular growth upon renewed nutrient abundance. In this respect, re-addition of a nitrogen source like ammonium, to nitrogen-starved, glucose-repressed cells, triggers a rapid activation of the so-called FGM pathway. This ammonium-induced activation of FGM signalling requires ammonium uptake through the Mep1 or Mep2 ammonium permeases. In this work, we found that passive diffusion of ammonium or its structural analogue methylammonium across the plasma membrane of mep1∆ mep2∆ mep3∆ cells, can just as well induce a clear FGM signalling response. Hence, ammonium and MA can be sensed inside the cell in a Mep-independent way. Metabolization of ammonium to glutamate or glutamine was shown not to be required for this response. On the other hand, the majority of the NH3 or CH3-NH2 molecules that diffuse across the plasma membrane, will be protonated inside the cytoplasm and thus cause a rise of the cytosolic pH. Using a pH sensitive GFP mutant allele, this intracellular alkalinization could be quantified. The MA-induced alkalinization could be counteracted stepwise, by addition of increasing amounts of the weak base sorbic acid. Under these conditions, the amount of MA that accumulated inside the cell remained very high. The activation of trehalase on the other hand, also decreased in a stepwise matter, in correlation with the extent of intracellular alkalinization. This strongly indicates that the Mep-independent ammonium or MA sensing is actually caused by an intracellular pH rise, and not by direct intracellular sensing of these molecules. This result indicated that Mep2, in analogy to the EcAmtB ammonium transporter, might also transport NH3, and that the Mep2-mediated ammonium sensing was actually caused by the resulting intracellular alkalinization. However, ammonium or MA addition to a mep1∆ MEP2 mep3∆ strain, did not induce a measurable pH rise. Moreover, in cells where sorbic acid addition lowered the intracellular pH with an entire pH unit, a clear MA-induced trehalase activation could still be seen. This clearly demonstrates that the Mep2-mediated trehalase activation after MA addition cannot be caused by an intracellular alkalinization, and by extension the same accounts for ammonium. This experiment strongly supports a role for Mep2 as an ammonium sensor in the activation of the FGM pathway. Furthermore, it suggests that Mep2 mediates the uptake of NH4+ into the cell. To investigate the transport and sensing functions of the Mep2 permease, a series of mutants was constructed. The residues that have been mutagenized were all part of regions of Mep2 that are exposed to the cytoplasm. In the majority of the mutants, transport and sensing functions of Mep2 were coupled. This means that if a mutant had a reduction of the transport rate, its trehalase activation was usually affected to a similar extent, which indicates that a conformational change that occurs during the translocation of ammonium or MA from the periplasm to the cytoplasm, acts as the trigger for the activation of FGM signalling. On the other hand, trehalase and transport could be partially uncoupled by highly specific mutations. In the Mep2D279AY280G, Mep2D279A, Mep2Y280R and Mep2K60AH61G mutants, trehalase activation after re-addition of ammonium and/or MA was lowered to a much larger extent than the corresponding uptake and intracellular accumulation of these substrates. These results strongly argue against an intracellular sensing mechanism for ammonium or MA, and add further support to the role of Mep2 as sensor for these substrates. Other research groups have demonstrated that Mep2 also acts as an ammonium sensor for the induction of pseudohyphal growth upon ammonium limitation. Using our collection of Mep2 mutants, we were able to demonstrate that the role of Mep2 as a sensor after ammonium resupplementation to nitrogen starved cells does not correlate with its role as a sensor for the induction of filamentous growth upon ammonium limitation. In this study, we could also demonstrate that PKA and Sch9, two components known to be required for amino acid signalling, are also required for the ammonium-induced FGM signalling. Furthermore, we tried to find new components of the FGM signalling pathway lying downstream of the Mep2 ammonium sensor. A screening method was designed that allowed us to isolate mutants that are affected in ammonium-induced signal transduction. Using a transposon-mutagenized yeast library, 8 mutants could be isolated with a defect in ammonium signalling. The transposon insertions in these mutants were mapped to the CYR1, CDC25, PRR2 and RSN1 genes. Cyr1 and Cdc25 most probably only have an indirect role in ammonium signalling, while Prr2 and Rsn1 were shown not to be involved in this signalling response. Finally, another screening was performed with the goal of identifying proteins that specifically interact with Mep2. Using the so-called split-ubiquitin system, we were able to identify 26 putative Mep2-interaction partners of several functional categories. Of a number of candidates, the corresponding deletion strain has already been tested for [14C]MA uptake and ammonium-induced trehalase activation, however, most deletion mutants were hardly affected in these properties. A strong effect was only seen for the ssb2∆ strain which had a significantly lowered ammonium signalling response, although this phenotype was only seen in the BY4741 background and not in a ssb2∆ strain of the ∑1278b background.
Listing 1 - 2 of 2 |
Sort by
|