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L’alpha-synucléine (aSyn) est une protéine intrinsèquement désordonnée qui est synthétisée majoritairement dans le cerveau. Son agrégation en fibres amyloïdes qui s’accumulent dans la substantia nigra pars compacta sous forme d’inclusions intracellulaires appelées corps de Lewy, est associée à la maladie de Parkinson. Le processus d'agrégation est complexe et implique la formation d’espèces de tailles, structures et morphologies diverses. Par ailleurs, l’aSyn peut subir plusieurs modifications post-traductionnelles (MPT). Par exemple, 90% de l’aSyn retrouvée dans les corps de Lewy est phosphorylée au niveau de la sérine 129 (S129), alors que seulement 5% de l’aSyn l’est chez une personne saine. Le mécanisme moléculaire responsable de la neuro-dégénérescence, la nature exacte des formes toxiques et le rôle des MPT sont encore toutefois mal connus ; leur élucidation est toutefois cruciale afin d’identifier des cibles thérapeutiques. Etant donné que les protéines adoptent une conformation différente dans l’état monomérique, oligomérique et fibrillaire, l’utilisation de sondes structurales moléculaires, sensibles et spécifiques de chacune des espèces formées au cours du processus d’agrégation, est une approche de choix pour mieux comprendre au niveau moléculaire le processus d’agrégation.
Dans ce contexte, la première partie de ce travail a consisté à générer des outils, i.e. des protéines chimères constituées de la protéine BlaP et de régions de l’aSyn, destinés à orienter la génération et/ou la sélection de sondes structurales (Nanobodies et Nanofitines) spécifiques de ces régions. Les régions de l’aSyn sélectionnées sont le domaine NAC qui compose le cœur des fibres amyloïdes et la S129 phosphorylée. Au total, cinq chimères ont été construites par recombinaison homologue : quatre d’entre elles (BlaP-aSyn1, 2, 3 et 4) contiennent des tailles différentes du domaine C-terminal (résidus 96-140 contenant la S129) afin d’estimer la taille minimale d’un insert permettant son accessibilité à la surface de BlaP ; la 5ième (BlaP-aSyn5) contient l’entièreté du domaine NAC. Les cinq chimères ont été produites de manière recombinante dans E.coli et purifiées par chromatographie d’affinité aux ions Ni2+ et échangeuse d’ions. Des mesures de dichroïsme circulaire et de fluorescence intrinsèque ont permis de montrer que les cinq protéines chimères ont des structures secondaires et tertiaires semblables à celle de la protéine BlaP. Des expériences de dot-blot, de BioLayer Interferometry BLI et/ou de phosphorylation de la sérine 129 par la kinase PKL3 ont permis d’établir que les régions d’intérêt des inserts des protéines BlaP-aSyn4 et BlaP-aSyn5 (i.e. la sérine129 et la région NAC, respectivement) étaient correctement exposées et accessibles à la surface de la protéine porteuse. En revanche, la sérine129 n’est que marginalement accessible à la kinase dans les chimères BlaP-aSyn1, BlaP-aSyn2 et BlaP-aSyn3. Afin de s’assurer du pouvoir immunogène des séquences d’aSyn insérées dans BlaP, des souris ont été immunisées avec BlaP-aSyn5. La présence d’IgG spécifiques du NAC dans les séra des souris, déterminée par Western-Blot, confirme l’immunogénicité de l’insert dans la protéine chimère BlaP-aSyn5. L’ensemble des résultats obtenus indiquent que les chimères BlaP-aSyn4 et BlaP-aSyn5 phosphorylées par PKL3 peuvent être utilisées pour générer/sélectionner des sondes structurales spécifiques de la S129 phosphorylée et du NAC de l’aSyn.
La seconde partie de ce travail s’est centrée sur la génération d’un Diabody, résultant de la fusion de deux Nanobodies spécifiques de l’aSyn (i.e. Nb-Syn2 et de Nb-Syn87) via un peptide linker et sur l’étude de l’effet de sa liaison sur les cinétiques d’agrégation de l’aSyn. L’affinité du Diabody pour l’aSyn monomérique et fibrillaire n’est que marginalement augmentée par rapport à celle du Nanobody le plus affin, Nb-Syn87. Le peptide linker utilisé ne permet probablement pas aux deux Nanobodies de s’orienter correctement pour fixer simultanément leur épitope respectif. Des expériences préliminaires, visant à comparer les effets du Diabody et des Nanobodies Nb-Syn2 et NbSyn87 sur l’agrégation de l’aSyn en fibres amyloïdes, ont été réalisées via des mesures de la fluorescence de la ThT et de microscopie électronique à transmission. Dans les conditions utilisées, le Diabody et Nb-Syn87 inhibent complètement la formation de fibres amyloïdes par l’aSyn alors que Nb-Syn2 l’inhibe partiellement. L’inhibition de l’agrégation par Nb-Syn2 et Nb-Syn87 est en désaccord avec les résultats disponibles lorsque ce travail a été initié : les deux Nanobodies étant décrits comme n’affectant pas les cinétiques d’agrégation de l’aSyn. Toutefois, une publication très récente (août 2017) décrit des résultats similaires aux nôtres. Les disparités observées d’une étude à l’autre, pourraient s’expliquer par des faibles variations dans les conditions d’agrégation utilisées (avec ou sans seeds, avec ou sans agitation, ...) pour former les fibres et elles soulignent à nouveau la complexité du processus d’agrégation et l’intérêt d’utiliser des sondes structurales pour son étude.

Sciences du vivant > Biochimie, biophysique & biologie moléculaire

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L’essor de l’industrie biopharmaceutique a conduit à un besoin croissant de production de grandes quantités de protéines recombinantes. Une solution pour pallier à cette demande consiste à produire ces protéines d’intérêt sous forme de corps d’inclusion, des agrégats insolubles apparaissant suite à la surexpression des protéines dans les bactéries. Cependant, les corps d’inclusion doivent être solubilisés pour être utilisés, ce qui entraîne la dénaturation de la protéine recombinante. L’étape de renaturation qui s’ensuit est souvent l’étape limitante dans l’utilisation des corps d’inclusion comme moyen de production car aucune technique universelle n’a été découverte à ce jour. Ainsi, le repliement doit être étudié au cas par cas avec chaque protéine. De plus, les rendements obtenus pour des protéines complexes de grandes tailles sont généralement faibles (inférieurs à 30%).
Ce travail s’est focalisé sur le repliement d’une protéine tétramérique complexe produite à partir de corps d’inclusion, la β-lactamase L1, en utilisant la méthode de renaturation en présence du couple SDS-MPD. La détermination des conditions optimales de repliement a été réalisée grâce à un programme de plan d’expérience (Design of Experiment), couplé à l’assistance d’une plateforme de pipetage automatique disponible à Robotein® (http://www.robotein.ulg.ac.be/).
Grâce à cette technique, les différentes conditions physico-chimiques influençant le repliement ont pu être déterminées. Ce travail a également permis de mettre en évidence deux facteurs possédant une importance cruciale lors du repliement de la β-lactamase : l’intégrité structurale des monomères et la pureté de l’échantillon de corps d’inclusion. La présence d’une forme anormale de L1 dans une première production a conduit à une chute drastique du taux de repliement de la protéine. En outre, des corps d’inclusion bruts n’ayant pas subi d’étape de purification ont également conduit à une diminution du taux de repliement de L1. En tenant compte de tous ces paramètres, des taux de repliement de la β-lactamase supérieurs à 70% ont pu être obtenus. Ces résultats de rendements exceptionnellement élevés pour une protéine complexe multimérique confortent le rôle du couple SDS-MPD dans la renaturation de protéines.

Corps d'inclusion --- Métallo-β-lactamase --- Haut débit --- Repliement des protéines --- Sciences du vivant > Biochimie, biophysique & biologie moléculaire

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Le processus de cancérisation peut provenir de la perturbation de différents mécanismes cellulaires : transcription, traduction, réparation de l’ADN, etc. Ici, nous nous intéressons à l’épissage alternatif. De nombreuses recherches ont documenté les conséquences des altérations de ce mécanisme et de ses régulateurs . Lors de ce projet, deux RNA Binding Protein impliquées dans la régulation de l’épissage sont étudiées : il s’agit de RBFOX2 et RBM39. RBFOX2 est connue pour activer ou inhiber l’épissage en fonction de la séquence consensus (U)ACUAG. Elle est notamment associée à la transition épithélio-mésenchymateuse, un processus important lors du développement de métastases. Cette protéine est surexprimée dans les cancers du sein et des ovaires. RBM39, quant à elle, était principalement connue pour son rôle de coactivateur transcriptionnel mais de plus en plus d’études montrent qu’elle participe également au mécanisme d’épissage. En effet, elle interagit directement avec certains éléments du spliceosome tels que U2AF65. Elle régule ainsi de nombreux processus physiologiques dont la prolifération cellulaire. Comme RBFOX2, RBM39 est également associée à certains types de cancers (sein, poumon, etc). Un troisième acteur, régulé positivement par RBM39, est également ajouté dans cette étude : il s’agit du facteur de transcription dimérique AP-1, et plus précisément d’une de ses sous-unités c-Jun. Ce dernier étant un proto-oncogène, il est connu pour être impliqué dans le développement de certains cancers. Par conséquent, de plus en plus de traitements ciblant l’ interaction entre c-Jun et RBM39 sont développés comme thérapie en cancérologie, par exemple pour le cancer du sein.
Le projet tente de mieux comprendre l’influence de ces 3 différents acteurs les uns pour les autres. Plus particulièrement, nous nous sommes penchés sur la coopération entre RBFOX2 et RBM39. En effet, ces 2 protéines ont des partenaires communs et sont chacune des régulateurs de l’épissage. Nous avons découvert que ces 2 protéines s’influencent entre elles et plus encore, qu’elles interagissent directement ensemble. Cependant, leur rôle respectif semble être antagoniste au niveau de la régulation de l’épissage et également au niveau de l’influence sur la transcription d’AP-1.

RNA Binding Protein, RBFOX2, RBM39, c-Jun, interaction protéique, épissage alternatif, transcription --- Sciences du vivant > Biochimie, biophysique & biologie moléculaire