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Despite the existence of tumor-infiltrating T lymphocytes (TILs), the tumor manages to grow. The host laboratory has found that these TILs have dysfunctional cytokine secretion and lytic capacities. Treating TIL with a galectin antagonist can partially correct these defects. Galectins are lectins secreted in the tumor environment by tumor cells and macrophages. They bind to polysaccharide motifs that decorate the cell surface receptors. They can form galectin-glycoprotein lattices, wich decrease the mobility of these receptors. The host laboratory thought that TIL covered galectins had a poor ability to be activated. The Lck kinase is known to interact with both glycoproteins CD45 and LFA-1 expressed at the T cell surface. LFA-1 is an adhesion molecule involved in stabilizing intercellular interactions and the CD45 phosphatase is involved in the regulation of intracellular signaling. The host laboratory observed a lack of motility of these two receptors at the contact area between a TIL and its target, lack of motility that could be corrected by a treatment with galectin antagonists. We made preliminary experiments to trap CD45 and LFA-1 in artificial lattices by capturing these surface receptors with cross-linked anti-FLA-1 and anti-CD45 antibodies. These artificial lattices should reduce the motility of these receptors and mimic galectin- glycoprotein lattices. It will then be possible to examine whether this lack of receptor motility disrupt the secretion of cytokines by T lymphocytes as do galectins in TILs.

Lymphocyte Specific Protein Tyrosine Kinase p56(lck) --- CD8-Positive T-Lymphocytes --- Neoplasms --- Immunological Synapses

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In mice chronically infected with a virus, T lymphocytes undergo persistent activation and stimulation which results in a dysfunctional state known as "T cell exhaustion". In this state, T cells lack effector functions and are unable to proliferate. This loss of function has been attributed to the presence of inhibitory receptors. In several pathologies like chronic viral infection, graft or cancer, human T cells are also continuously exposed to their specific antigen. By analogy with the murine T cells observed in chronically infected mice, human T cells have also been described as exhausted. However the role of inhibitory receptors has not been proven in human T lymphocytes. We have proposed to reconsider this issue with in vitro expanded human T cells. To mimic antigen persistence, a protocol of repeated stimulations of human T cells has been developed. The T cells obtained with this protocol become dysfunctional, but the implication of inhibitory receptors has been ruled out. The dysfunctional T cells have been compared to their functional counterparts by transcriptome analysis. Several genes that were differentially expressed were identified. We decided to focus on 3 main candidates: TIMP3 and SPARC which are upregulated in dysfunctional T cells and ITK which is down regulated. I obtained dysfunctional T cells using the repeated stimulations protocol, either using stimulating T2 cells or stimulating dendritic cells, each of them loaded with a relevant antigenic peptide. I confirmed the upregulation of TIMP3 and SPARC genes in dysfunctional T cells and confirmed this increase at the protein level. This upregulation is particularly significant, as these candidate genes are not expressed in functional T cells. I also analyzed their expression in T cells extracted from several human pathologies samples and interestingly, I was able to demonstrate their expression in this context. I forced the expression of either TIMP3 or SPARC by lentiviral infection of functional T cells. On the other hand, I used polyclonal antibodies directed against TIMP3 and SPARC proteins, and evaluated the impact on T cell functions. This treatment allowed a slight increase in T cell functions in a single experiment. In order to identify the action mechanism of TIMP3 in T cell, I used chemical inhibitor to mimic its action by inhibiting its targets in functional T cells. I evaluated their functions, but no impact was noted. Regarding ITK, I forced its expression in functional T cells, which will undergo the repeated stimulation protocol. This will allow evaluating whether its expression is sufficient to maintain T cell functions. I also used chemical inhibitors to reproduce the loss of its expression; it induced a negative impact on T cells functions.In the future, if the implication of the candidate genes is confirmed, it will be possible to consider broader perspectives. For example, the transfer of T cells which would be genetically modified either to suppress or sustain the expression of the candidate genes could be considered. Lors d'infections murines chroniques, les lymphocytes T sont soumis à des stimulations permanentes qui entrainent l'apparition d'un état « épuisé ». Ce dysfonctionnement est dû à l'expression majorée de récepteurs inhibiteurs. Dans diverses pathologies comme les infections virales chroniques, le cancer ou les greffes, les lymphocytes T humains subissent ce même type d'exposition continue à leur antigène. Par analogie avec les pathologies murines, les lymphocytes T humains ont également été qualifiés d' « épuisés ». Chez l'homme, toutefois, l'implication des récepteurs inhibiteurs n'a pas été démontrée. Afin d'imiter la persistance de l'antigène, un protocole de stimulations répétées des lymphocytes T a été mis en place. Les lymphocytes T obtenus sont dysfonctionnels, mais l'implication des récepteurs inhibiteurs a été exclue. Une analyse de transcriptome a été réalisée pour comparer ces lymphocytes T dysfonctionnels aux lymphocytes T fonctionnels. Plusieurs gènes différentiellement exprimés ont été identifiés. Nous nous sommes focalisés sur 3 candidats : TIMP3 et SPARC qui sont surexprimés dans les lymphocytes T dysfonctionnels, et ITK qui voit au contraire son expression diminuer. J'ai obtenu des lymphocytes T dysfonctionnels par ce protocole, en employant d'autres types de cellules stimulantes : des cellules T2 ou des cellules dendritiques en tant que cellules stimulantes. J'ai confirmé la surexpression des gènes TIMP3 et SPARC dans les lymphocytes T dysfonctionnels, et mis en évidence leur expression protéique. J'ai également détecté leur expression dans des lymphocytes T extraits de diverses pathologies humaines. Concernant les gènes candidats, j'ai agi sur leur expression génique d'une part et sur leurs fonctions protéiques d'autre part. Concernant TIMP3 et SPARC, j'ai induit leur expression dans des lymphocytes fonctionnels par infection lentivirale. Dans le cas d'ITK, j'ai induit son expression dans des lymphocytes T fonctionnels qui seront soumis au protocole de stimulation chronique. Cela permettra d'évaluer si le maintien de son expression est suffisant pour protéger les lymphocytes T de l'état dysfonctionnel. J'ai employé des anticorps polyclonaux dirigés contre les protéines TIMP3 et SPARC. Ils ont permis une légère augmentation des fonctions lymphocytaires dans une expérience unique. Par ailleurs, afin d'identifier le mécanisme d'action de TIMP3 dans les lymphocytes T, j'ai mimé son action par l'inhibition de ses cibles dans des lymphocytes T fonctionnels. Cela n'a eu aucun impact sur les fonctions lymphocytaires. Concernant ITK, j'ai employé un inhibiteur chimique qui a exercé un impact négatif sur les fonctions lymphocytaires. A l'avenir, si l'implication des protéines candidates TIMP3 et SPARC se confirme, des perspectives plus larges seront envisageables. Au vu de leur action inhibitrice sur le système immunitaire, il serait intéressant d'inhiber leur action dans le cas d'infections virales chroniques ou de cancer. Au contraire, leur présence constituerait un atout dans le cas de pathologies auto-immunes ou de greffes. Si leur implication est infirmée, il serait intéressant de considérer les autres gènes candidats identifiés par l'analyse de transcriptome. L'intervention d'autres mécanismes également, épigénétiques par exemple, ne doit pas être négligée.

T-Lymphocytes --- Lymphocyte Function-Associated Antigen-1

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Des antigènes tumoraux, exprimés par le mélanome MZ2-MEL et reconnus par des lymphocytes T cytolytiques (CTL) provenant du même patient, ont été identifiés. Ils sont codés par les gènes MAGE 1 et 3, des gènes exprimés dans de nombreuses tumeurs, mais silencieux dans les tissus normaux à l’exception du testicule. Récemment, le gène BAGE, qui code un nouvel antigène reconnu par des CTL sur MS2-MAL, a été isolé. Le gène BAGE code un peptide de 9 acides aminés présenté aux CTL par la molécule du complexe majeur d’histocompatibilité HLA-Cw*1601. Nous avons étudié l’expression de ce gène dans plusieurs tissus. BAGE est exprimé principalement dans les mélanomes, les tumeurs de la vessie, du rein, et dans certaines tumeurs du poumon ; par contre, comme les gènes MAGE, il n’est pas exprimé dans les tissus normaux et fœtaux à l’exception du testicule. Huit ADNc ont été isolés et séquencés. Ils semblent posséder une même phase de lecture ouverte (ORF) mais diffèrent au niveau de leur extrémité 3’ non codante. Ces résultats suggèrent l’existence d’une famille de gènes apparentés ou un processus d’épissage alternatif. D’autres données corroborent ces hypothèses. En effet, nous avons observé deux bandes sur un Northern Blot et plusieurs bandes sur un Southern Blot hybridés avec un court fragment de BAGE centré sur l’ORF. A partir de deux mélanomes et de deux testicules normaux exprimant le gène BAGE, nous avons amplifié par PCR et séquencé des ADNc contenant la séquence codante de ce gène. Six ADNc légèrement différents de l’ADNc de BAGE ont été identifiés. L’isolement d’au moins trois ADNc différents dans un des testicules normaux nous a permis de confirmer l’existence d’une famille de gènes BAGE.
En recherchant d’autres ADNc par criblage d’une bibliothèque d’expression de testicule, nous avons identifié de manière inattendue l’ADNc d’un gène encore inconnu dans les banques de données. Ce gène, que nous avons appelé TAGE, présente le même profil d’expression que BAGE. Il est silencieux dans les tissus normaux à l’exception du testicule. Son expression est toutefois limitée à de rares tissus tumoraux.
Ces caractéristiques nous mènent à penser que TAGE pourrait également coder un antigène tumoral humain.

Antigens, Neoplasm

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On sélectionne alors les peptides synthétiques qui co-éluent avec des peptides naturels de même masse et on vérifie la séquence des peptides naturels par spectrométrie de masse en tandem. En utilisant cette stratégie, l’équipe du PrHG Rammensee a démontré la présence d’un peptide de MAGE-1, KVLEYVIKV, à la surface d’une cellule tumorale HLA-A2. Aucun CTL ayant une avidité suffisante pour reconnaître une cellule tumorale n’a pu être isolé par cette équipe. L’obtention d’un CTL spécifique n’a rien d’une opération évidente : la fréquence d’un CTL spécifique d’un complexe HLA-peptide donné est probablement de l’ordre de 5x10[-8] dans le sang d’un individu sain. Nous avons décidé d’utiliser des multimères HLA-peptide comme outil d’enrichissement de lymphocytes spécifiques rares.
Un peptide de MAGE-1 reconnu par des CTL sur des cellules tumorales HLA-A2
Un multimère HLA-A2 a été construit avec le peptide de MAGE-1, KVLEYVIKV pour tenter d’isoler un clone de lymphocytes T spécifiques. Dans des expériences préliminaires, un grand nombre de lymphocytes T ont été marqués avec un multimère couplé à un fluorochrome, puis avec un anticorps spécifique du fluorochrome couplé à des billes magnétiques. Après passage dans une colonne entourée d’un champ magnétique, les cellules de la fraction positive ont été triées une seconde fois en cytométrie en flux de façon à sélectionner les lymphocytes T CD8 fortement marquées avec le multimère. Des populations clonales ont été obtenues par stimulations antigénique en mircopuits. Malheureusement, de nombreux clones étaient capables de se lier au multimère, mais seule une petite fraction d’entre eux étaient stimulés par des cellules chargées en peptide ou des cellules tumorales exprimant le gène d’intérêt. Ceci est probablement du au fait que les multimères se lient également à des lymphocytes T qui ont une trop faible affinité pour effectuer leurs fonctions effectrices ou pour transduire un signal menant à une prolifération en présence de cellules présentant le peptide.
Nous avons voulu améliorer la technique dans le but d’isoler uniquement des CTL capables de reconnaître des cellules chargées en peptide et de proliférer. Ces expériences sont décrites dans le chapitre 1. Comme précédemment, un grand nombre de lymphocytes T (170 millions) ont été marqués avec le multimère A2/MAGE-1 couplé à de la phycoérythrine (PE), puis avec un anticorps anti-PE couplé à des billes magnétiques. Les cellules ont ensuite été triées par passage dans une colonne entourée d’un champ magnétique. Au lieu d’isoler directement des précurseurs spécifiques par cytométrie en flux et de les cloner, nous avons distribué les cellules de la fraction positive obtenue par tri magnétique et ainsi enrichie en cellules se liant au multimère, dans 96 micropuits contenant chacun environ 8000 cellules. Ces cellules ont été stimulées avec des cellules dendritiques chargées avec le peptide. Après deux semaines de stimulation, les microcultures ont été testées pour la présence de lymphocytes capables de se lier aux multimères. Seules les microcultures où des lymphocytes T étaient capables de proliférer en présence du peptide plus rapidement que les autres cellules, contenaient suffisamment de lymphocytes marqués par le multimère que pour pouvoir être considérées comme positive. Nous avons ainsi obtenu 11 microcultures positives sur 96. Certaines microcultures ont été clonées et 3 clones indépendants ont été obtenus. Ces clones étaient capables de se lier au tétramère, de lyser des cellules chargées avec le peptide et des cellules tumorales HLA-A2 exprimant MAGE-1. Nous avons donc démontré qu’il existe dans le répertoire des lymphocytes T dirigés contre le peptide de MAGE-1 présenté par HLA-A2 ayant une avidité suffisante que pour reconnaître des cellules tumorales. Des vaccinations thérapeutiques pourraient être menées avec ce peptide chez de nombreux patients : les molécules HLA-A2 sont exprimées par environ 45% de la population caucasienne et asiatique et le gène MAGE-1 dans environ la moitié des mélanomes et des carcinomes de l’œsophage et du poumon.
Un peptide de MAGE-4 reconnu par des CTL sur des cellules tumorales HLA-A24
Dans le cadre d’une collaboration avec un groupe japonais, nous nous sommes efforcés d’identifier des peptides présentés par les molécules HLA-A24, qui sont présentes dans 40% de la population asiatique et 20% de la population caucasienne. Ce travail est décrit dans le chapitre 2. Nous sommes partis de l’observation suivante : un peptide de MAGE-1 avait été décrit comme présenté par HLA-A24 à des CTL. En analysant les séquences des autres protéines MAGE dans la région du peptide MAGE-1.A24, nous avons repéré un peptide MAGE-4 contenant des « motifs d’ancrage » pour HLA-A24. Les antigènes de MAGE-4 sont des cibles intéressantes : MAGE-4 est exprimé dans plus de la moitié des carcinomes de l’œsophage, du poumon, de la vessie, et ceux de la sphère ORL. Le peptide a été synthétisé et s’est révélé capable de se lier à HLA-A24. Nous avons ainsi pu construire un multimère HLA-A24 contenant ce peptide et obtenir un clone CTL spécifique en utilisant le multimère comme outil d’enrichissement ainsi que l’approche décrite ci-dessus. Sur 51 microcultures, 3 contenaient des cellules capables de se lier au tétramère. Un clone qui lysait des cellules présentant le peptide de MAGE-4 a été obtenu. Le clone reconnaissait également des cellules tumorales HLA-A24 exprimant MAGE-4, démontrant par là l’avidité suffisante du CTL et le bon apprêtement du peptide par des cellules tumorales. Cependant, seules les cellules traitées avec de l’IFN-gamma étaient reconnues par le CTL. Cela pourrait être partiellement expliqué par une augmentation d’expression des molécules HLA, un phénomène bien connu en présence d’IFN-gamma. Un autre effet connu de l’IFN-gamma est l’induction de l’expression d’un complexe de protéases impliqué dans l’apprêtement des peptides antigéniques, l’immunoprotéasome. Nos résultats pourraient être interprétés de la façon suivante : les cellules tumorales exprimant des immunoprotéasomes apprêtent mieux le peptide de MAGE-4 que celles exprimant des protéasomes standards présents dans les cellules non –traités à l’IFN-gamma. Des expériences ultérieures sont envisagées pour répondre à cette question. Nous pensons en effet qu’il est important de prendre en compte dans les stratégies vaccinales le fait que des antigènes pourraient être apprêtés de manières différentes selon que l’on soit ou non dans des sites inflammatoires où l’IFN-gamma pourrait être présent Identification de gènes codant des antigènes spécifiques de tumeur
Que notre système immunitaire puisse nous débarrasser de certains cancer est un rêve dont les bases expérimentales datent des années 40. En utilisant des lymphocytes T cytolytiques (CTL) isolés d’une patiente ayant guéri d’un mélanome, le premier gène responsable de l’expression d’un antigène de tumeur humaine a été identifié en 1991. Ce gène, MAGE-1, code une protéine dont un peptide est présenté à la surface de plusieurs types de tumeurs mais pas à la surface des cellules normales. Des cellules cancéreuses présentent donc à leur surface des antigènes, absents des cellules normales, qui peuvent servir de cibles à des CTL capables d’éliminer les cellules cancéreuses. Une série de gènes MAGE ont ensuite été identifiés. Ces gènes, comme le gène MAGE-1, sont exprimés dans un grand nombre de tumeurs de types histologiques variés. Ils sont par contre silencieux dans les cellules normales, à l’exception des cellules du testicule et du placenta, que n’expriment pas de molécules HLA et ne présentent donc pas de peptides aux lymphocytes T. Les antigènes provenant des protéines MAGE paraissent avoir les qualités requises pour servir de vaccin contre les cellules cancéreuses car ils sont présents sur de nombreuses tumeurs, ce qui permettrait d’envisager des vaccins applicables à un grand nombre de patients.
Vaccinations thérapeutiques
Plusieurs essais de vaccinations avec des peptides MAGE ont été achevés. Un peptide MAGE-3 présenté par HLA-A1 a été injecté à des malades porteur de mélanomes métastatiques. Sept patients sur 25 ont montré des régressions tumorales dont trois furent complètes et deux perdurent depuis plus de 4 ans. Par la suite, des vaccins contenant d’autres peptides MAGE, de la protéine MAGE-3, un poxvirus contenant une séquence codant des peptides ont été injectés. On peut conclure de ces essais que les vaccinations sont suivies de régressions tumorales chez une minorité de patients et que, parmi les modalités de vaccination testées, aucune ne semble réellement supérieure aux autres. Assez curieusement, les injections de peptide seul, à priori peu efficace pour stimuler une réponse immunitaire, ne sont pas moins efficaces du point de vue clinique que d’autres modalités.
Proposer un vaccin à un plus grand nombre de patients en identifiant de nouveaux peptides antigéniques
Les différents gènes MAGE codent plus que probablement de nombreux peptides antigéniques présentés par diverses molécules HLA. Il est important de continuer à identifier de nouveaux antigènes de tumeurs. Cela permettra bien sûr de proposer une immunothérapie à un plus grand nombre de patients mais surtout, d’utiliser simultanément plusieurs antigènes dans un seul vaccin. L’expression de l’antigène est souvent hétérogène au sein de la tumeur ; un vaccin multi-peptides pourrait donc augmenter l’efficacité de l’immunisation en diminuant le risque de sélectionner des variants tumoraux ayant perdu l’expression du peptide cible. Pour améliorer les méthodes de vaccination, il est également important d’évaluer le nombre de lymphocytes T anti-MAGE activés par la vaccination. Dans le cas où un peptide est injecté, il est possible d’utiliser un outil spécifique et sensible : un complexe soluble HLA/peptide marqué avec fluorochrome.
Différentes stratégies d’identification de nouveaux peptides MAGE ont été mises en œuvre au laboratoire. Il est possible d’obtenir un grand nombre de cellules dendritiques à partir de monocytes sanguins. Ces cellules dendritiques, considérées comme les cellules les mieux équipées pour activer les lymphocytes T naïfs, peuvent être infectées avec des poxvirus ou des adénovirus contenant la séquence codante d’un gène MAGE et utilisées pour stimuler des lymphocytes T autologues. Les microcultures, et ensuite les clones obtenus à partir des microcultures positives, peuvent être criblées pour leur capacité à lyser spécifiquement des cellules exprimant la protéine MAGE d’intérêt. Le clone anti-MAGE est alors utilisé pour identifier le peptide antigénique reconnu et la molécule HLA qui le présente. La dernière étape est de prouver que le clone CTL a une avidité suffisante pour lyser des cellules tumorales exprimant naturellement le gène MAGE et la molécule HLA. Cette approche, basée sur l’expression d’un gène entier et l’apprêtement de la protéine par des cellules dendritiques, facilité l’identification de peptides qui sont aussi présentés efficacement par des cellules tumorales. Par contre, les peptides identifiés peuvent être présentés par des molécules HLA peu exprimées par la population.
Si l’on veut identifier des peptides antigéniques présentés par des molécules HLA fréquentes, on peut utiliser une autre approche qui consiste dans un premier temps à repérer dans la séquence de la protéine des peptides contenant des acides aminés susceptibles d’ancrer ce peptide dans la molécule HLA. En effet, chaque molécule HLA contient des « poches » spécifiques capables d’accueillir des acides aminés spécifiques. Les peptides choisis en fonction de la présence de ces motifs d’ancrage sont synthétisés et testés pour leur capacité à se lier à la molécule HLA. Les peptides capables de se lier sont alors utilisés pour activer des lymphocytes T reconnaissant spécifiquement le peptide. En utilisant cette approche, le risque est d’isoler les lymphocytes T reconnaissant des cellules chargées en peptide mais incapables de lyser des cellules tumorales exprimant le gène. En effet, il n’existe pas aujourd’hui de bon outil pour prédire les peptides que seront apprêtés efficacement par une cellule tumorale. De rares équipes de recherche ont l’expertise pour démontrer la présence d’un peptide à la surface d’une cellule tumorale. Une stratégie envisagée consiste à synthétiser des peptides candidats et à les analyser par spectrométrie de masse. Parallèlement, des peptides « naturels » sont extraits d’une cellule tumorale, fractionnés par chromatographie HPLC et analysés en spectrométrie de masse.

HLA Antigens --- Antigens, Neoplasm