Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

Transfecties worden uitgevoerd om cellen recombinante eiwitten tot expressie te laten brengen.Als bij de transfectie het vreemde DNA willekeurig geïntegreerd wordt in het genoom van de cel zullen heterogene populaties gevormd worden. Plaatsspecifieke integratie via homologe recombinatie van dit vreemde DNA zal isogene populaties als gevolg hebben. Flp-In™ technologie omvat cellijnen en plasmiden waar in beide een FRT (Flippase Recognition Target) sequentie aanwezig is. Deze FRT sequentie is aanwezig op een specifieke locatie in het genoom. Homologe recombinatie vindt plaats ter hoogte van deze FRT sequenties mbv het flp recombinase enzyme waardoor het expressie plasmide specifiek geïntegreerd wordt ter hoogte van de genomische FRT sequentie. Zo ontstaat een isogene celpopulatie. Het CBS team binnen Ablynx heeft verschillende HEK293H Flp-In™ cellijnen gegenereerd met een FRT sequentie op telkens andere plaatsen in het genoom. De transcriptionele activiteit werd gemeten aan de hand van een reportergen (hOX40L).In dit eindwerk werden zes HEK293H Flp-In™ cellijnen (met verschillende hOX40L expressieniveaus) samen met een commerciële HEK293 Flp-In™ cellijn gekarakteriseerd.Transfectie efficiëntie en expressieniveaus van verschillende recombinante eiwitten werden vergeleken. De tijd nodig om foci te bekomen na transfectie en het aantal foci waren een maat om de transfectie efficiëntie te evalueren. De expressie van de recombinante eiwitten werd bepaald met Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). Zoals verwacht vertoonde, na de experimenten, de commerciële HEK293 Flp-In™ cellijn gemiddeld de hoogste expressie van het doelwit eiwit. Twee HEK293H Flp-In™ high cellijnen werden niet bevonden als geschikte vervanging voor de commerciële HEK293 Flp-In™ cellijn wegens lagere transfectie efficiëntie en lage expressie van het doelwit eiwit. Twee HEK293H Flp-In™ low cellijnen werden wel als geschikt bevonden voor verder gebruik, zij vertoonden hoge transfectie efficiëntie en lage expressie van het doelwit eiwit.

Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

In het laboratorium van de ‘root development’-groep wordt onderzoek gedaan naar zijwortelinitiatie bij verschillende modelplanten. Zijwortels zijn namelijk van cruciaal belang voor de verankering en het opnemen van water en voedingsstoffen. Er wordt voor de studie van zijwortelinitiatie onder andere gebruik gemaakt van een lateraal wortel inducerend systeem (LRIS), dat het mogelijk maakt om zijwortels synchroon en overvloedig te induceren. Binnen dit project werd er onderzoek gedaan op Medicago truncatula, een modelplant voor leguminosen. Voor dit plantenspecies is een LRIS reeds geoptimaliseerd. Dit onderzoek had als doel de eerste celdelingen tijdens zijwortelvorming in de tijd te karakteriseren. Dit werd onderzocht door vibratoomsecties, microtoomsecties en qPCR. Karakterisatie van de eerste celdeling tijdens zijwortelinitiatie met behulp van microscopie leverde bij de microtoomsecties resultaten op. Eerste celdelingen van zijwortelontwikkeling zou starten rond 5 uur NAA behandeling. Via qPCR werd er vermoed dat de eerste celdeling na 4 uur NAA behandeling plaatsvindt.Een andere modelplant waar onderzoek op werd gedaan binnen dit project is Oryza sativa (rijst). Hiervoor werd een LRIS nog wat geoptimaliseerd door de concentratie van het auxine 1-naftaleenazijnzuur (NAA), die de beste zijwortelinductie gaf, te bepalen. Nadien werd ook bij rijst onderzocht wanneer de eerste celdeling plaatsvindt via microtoomsecties en qPCR. De qPCR en microtoomsecties geeft een vermoeden dat de eerste celdeling rond 6 uur NAA behandeling plaatsvindt. Ten slotte werd een LRIS in Arabidopsis thaliana (Arabidopsis of zandraket) gebruikt om de rol van vaatbundelweefselvorming gedurende zijwortelontwikkeling te bestuderen. De expressie van de genen die coderen voor transcriptiefactoren TMO5 en LHW en het enzym LOG4, allen betrokken bij de vorming van vaatbundelweefsel, werd bestudeerd tijdens zijwortelvorming. Hiervoor werd er gebruik gemaakt van fluorescente reporters in Arabidopsis, namelijk pTMO5-n3GFP, pLHW-n3GFP, pLOG4-n3GFP. Aangezien callusweefsel morfologische en moleculaire gelijkenissen vertoont met zijwortelvorming, werd ook hier aandacht aan besteed. De Arabidopsis reporterlijnen werden hiervoor aangebracht op callus inducerend medium en nadien op scheut inducerend medium. Aanwezigheid van het GFP wijst op expressie van de genen. LHW en LOG4 kwamen tot expressie tijdens laterale wortelvorming en callusvorming, TMO5 echter niet. Tijdens scheutvorming verzwakte het GFP signaal bij merkerlijnen pLOG4-n3GFP en pLHW-n3GFP en werd er een GFP signaal waarneembaar bij pTMO5-n3GFP.

Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

Voedingsmiddelen die behalve hun voedingswaarde bovendien ook voordelen hebben voor de gezondheid van de mens (functionele voeding), winnen de laatste jaren sterk aan populariteit. Probiotica zijn levende micro-organismen die een gezondheidsbevorderend effect hebben wanneer ze in voldoende hoeveelheden worden toegediend. Het heilzame effect van probiotica kan alleen gegarandeerd worden indien de bacteriën in staat zijn om zowel het productieproces van de voedingsmiddelen waarvan ze deel uitmaken, als de passage doorheen het gastro-intestinaal stelsel te overleven. Probiotische micro-organismen worden al toegepast in gefermenteerde melk- en yoghurtproducten, maar naast de zuivelindustrie wordt ook onderzoek verricht naar toepassing van probiotica in andere voedingsmiddelen zoals gefermenteerde worstwaren. In het huidige onderzoek werd beslist om droge gefermenteerde worstwaren te produceren waar zowel startercultuur SA-306 (bevat Lactobacillus sakei, Staphylococcus carnosus en Staphylococcus xylosus), als probiotica aan werden toegevoegd in gelijke hoeveelheden. De volgende probiotische culturen werden gebruikt: Lyofast BGP 93 (bevat Lactobacillus casei LC-01) en Lactobacillus paracasei LTH 2579. In een eerste fase van het onderzoek werden PCR’s, zowel in simplex als in multiplex toepassing, geoptimaliseerd om een snelle en accurate DNA-identificatie van Lactobacillus species mogelijk te maken. Aan de hand van de geoptimaliseerde PCR’s kon dan DNA-identificatie gebeuren van Lactobacillus sakei uit de startercultuur of van de probiotische micro-organismen (L. casei of L. paracasei LTH 2579) in alle stadia van het productieproces van droge gefermenteerde worstwaren. De verschillende multiplex PCR’s op geëxtraheerd DNA werden ook vergeleken met de multiplex kolonie PCR’s. Omdat bij kolonie PCR gebruik wordt gemaakt van intacte bacteriële cellen als template DNA en dus geen geëxtraheerd DNA nodig is, kan kolonie PCR aanzienlijke tijdwinst betekenen indien het aanwezige bacterieel DNA beschikbaar is voor amplificatie. In een tweede fase van het onderzoek werden verschillende methoden voor DNA-extractie geëvalueerd. Bij de eerste methode werd het bacterieel DNA vrijgesteld door middel van enzymatische lyse van de bacteriële celwand, bij de tweede methode gebeurde vrijstelling van het DNA door mechanische disruptie van de celwand zonder bijkomende zuivering en bij een derde methode werd het uitvoerig opgezuiverde DNA geprecipiteerd met isopropanol. Bij al deze methoden werd DNA geëxtraheerd dat bruikbaar was voor PCR.