Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

Choose an application

• Reference Manager
• EndNote
• RefWorks (Direct export to RefWorks)

To defend themselves against attack from microbial invaders, plants use a wide array of preformed and inducible defense mechanisms. Preformed barriers are present irrespective of whether the plant is attacked or not. Inducible defense responses, on the other hand, are activated upon pathogen recognition. Worldwide, Arabidopsis thaliana is used as a model plant in plant molecular biology research including studies on plant-microbe interactions. Application of different mutagenesis tools are typically used to characterize Arabidopsis genes involved in defense responses towards microbial invaders. This resulted in an increasing knowledge of the molecular mechanisms underlying the defense pathways leading to disease resistance. The objective of this doctoral thesis was the identification and the characterization of novel plant factors involved in the disease resistance towards the banana fungal pathogen Fusarium oxysporum f.sp. cubense race 4 ( Foc 4), the causal agent of the devastating Panama disease in banana. To do so, we utilized a reverse genetics approach in the model system Arabidopsis thaliana , which exhibits non-host resistance to Foc 4. In a first screening for altered susceptibility to Foc 4 in previously characterized defense response mutants, we show that the Arabidopsis defense response mutant esa1 displays susceptibility towards several Fusarium pathogens, including Foc 4. Additionally, we demonstrate that this susceptibility towards Foc 4 can be partially restored by expression of the pathogenesis-related genes PR1 and PR5 in the esa1 mutant. However, attempts to clone the ESA1 gene failed so far, not preventing this mutant to be used in an Arabidopsis-Foc 4 pathosystem for further research. In order to identify additional components involved in the defense response towards Foc 4, the esa1 mutant was supermutagenized using the activation tagging technique. At least two activation tagged esa1 super-mutants, esa1sfo1 and esa1sfo2 , showing enhanced s usceptibility towards Fo c 4 ( sfo ) as compared to esa1, were isolated. The esa1sfo1 mutant was retained for further characterization. We demonstrate that, additional to its enhanced susceptibility to Foc 4, esa1sfo1 also displays altered susceptibility towards two other pathogenic fungi, Botrytis cinerea and Alternaria brassicicola , while its susceptibility towards the bacterial pathogen Pseudomonas syringae remains unaltered, indicative for a role in the defense response against necrotrophs. Genetic characterization of this mutant revealed that the esa1sfo1 mutant bears a single-locus tag insertion in the 3'UTR of a putative RING-finger gene, predicting a protein member of the large Arabidopsis RING-type E3 ubiquitin ligase family, presumably functioning in targeted protein breakdown. Expression analysis indicated that the tag causes a 10-fold reduction in expression of this RING-finger gene in the esa1sfo1 mutant relative to wild-type and esa1 plants. Disease assays on a T-DNA insertion mutant of the RING-finger gene (wild-type background), as well as on self-generated wild-type and esa1 RING-RNAi lines show that the repression of this RING-finger gene is responsible for the altered susceptibility phenotypes of the esa1sfo1 mutant towards Foc 4. In addition, our data suggest that the SFO1 /RING-finger gene product can act independently of the esa1 mutation. Molecular characterization of the RING-finger gene product (SFO1) revealed that it is indeed active as an E3 ubiquitin ligase involved in poly-ubiquitination of target proteins, at least in vitro . Together, these data suggest that the SFO1 protein is a positive regulator of the Arabidopsis disease resistance against Foc 4, and that it mediates ubiquitin-dependent targeted protein breakdown of a so far unknown negative regulating compound of the plant's defense response. Furthermore, expression analysis of the SFO1 gene suggests that this gene is inducible by attack of B. cinerea , by the plant defense-mediating hormones salicylic acid (SA) and ET, as well as by reactive oxygen species. In contrast, SFO1 is repressed by attack of A. brassicicola and upon application of JA, consistent with SFO1 being differentially regulated by different pathogens and through mediation of different disease signaling pathways. Additionally, our results demonstrate that basal SFO1 gene expression is controlled by EIN2 and COI1, key-regulators of the ET- and JA-dependent signaling pathways, while under pathogen stress it is regulated by the JA- and ABA-dependent transcriptional regulator JIN1/MYC2. Together, our data suggest that SFO1 is regulated by multiple defense response related signaling pathways and that this protein acts as a positive regulator of the ET/JA-dependent disease signaling pathway effective against necrotrophs. Wereldwijd zorgen schimmelziekten voor enorme verliezen in de landbouwsector. Om deze verliezen zo veel mogelijk te beperken wordt gebruik gemaakt van grote hoeveelheden fungiciden die echter zorgen voor een enorme druk op het milieu. Bovendien zijn er nog steeds pathogenen die niet met fungiciden kunnen worden bestreden, zoals bijvoorbeeld vaatbundelpathogenen. De schimmel Fusarium oxysporum f. sp. cubense is een vaatbundelpathogeen welke de Panama ziekte veroorzaakt bij banaan. Deze schimmel infecteert de plant vanuit de bodem en verspreidt zich via het vaatbundelsysteem waardoor de plant verwelkt. Momenteel bestaat er geen effectieve behandeling voor deze ziekte en blijven geïnfecteerde bodems jarenlang onbruikbaar voor bananenteelt. De doelstelling van dit onderzoek was de identificatie en de karakterisering van genen die in planta een belangrijke rol vervullen in ziekteresistentie tegen de banaanschimmel F. oxysporum f. sp. cubense ( Foc ). In dit onderzoek maakten we daarvoor gebruik van een indirecte benadering, namelijk via de plant Arabidopsis thaliana, die wereldwijd gebruikt wordt als modelplant in plant moleculair onderzoek, waaronder de studie van plant-microbiële interacties, en die resistentie vertoont tegen Foc . Voor de identificatie en karakterisering van genen betrokken in de afweer van planten tegen microbiële belagers wordt meestal gebruik gemaakt van verschillende mutagenese-technieken. In dit onderzoek werd dan ook getracht om door middel van mutagenisatie Arabidopsis mutanten te verkrijgen die hun natuurlijke resistentie tegen de Fusarium pathogeen (partieel) hebben verloren. Een eerste screening voor verhoogde gevoeligheid voor Foc op eerder gekarakteriseerd Arabidopsis afweermutanten toonde aan dat de mutant esa1 verhoogde gevoeligheid vertoont voor deze pathogeen. Hoewel het ESA1 gen zelf nog niet kon worden geïdentificeerd, kon deze mutant toch gebruikt worden om via verdere mutagenisatie bijkomende resistentiegenen te identificeren die betrokken zijn bij de afweer van Arabidopsis tegen Foc . Twee mutanten esa1sfo1 and esa1sfo2 werden geïsoleerd die, vergeleken met de esa1 mutant, een verhoogde gevoeligheid vertoonden voor Foc . Genetische en functionele karakterisering van de esa1sfo1 mutant toonde aan dat de verhoogde gevoeligheid voor Foc veroorzaakt werd door een verminderde expressie van een RING-vinger gen coderend voor een eiwit behorend tot de familie van de Arabidopsis RING-vinger E3 ubiquitin ligasen en functionerend in de ubiquitine-gemediëerde eiwitafbraak. Deze gegevens suggereren dat het RING-vinger eiwit een positieve regulator is ziekte-afweer in Arabidopsis tegen Foc en dat het de ubiquitine-afhankelijke afbraak medieert van een tot nog toe onbekende negatieve regulator van de Arabidopsis afweerrespons tegen Foc .