Narrow your search

Library

UCLouvain (2)


Resource type

book (2)


Language

French (2)


Year
From To Submit

2010 (2)

Listing 1 - 2 of 2
Sort by

Book
Altérations épigénétiques dans les cellules tumorales : étude des mécanismes menant à la répression du gène RAM2

Loading...
Export citation

Choose an application

Bookmark

Abstract

DNA methylation profiles are profoundly altered in human tumors. While some genes become hypermethylated and repressed, others become hypomethylated and activated. The MAGEA1 gene for instance, is hypomethylated in a large variety of tumors. The molecular basis of such epigenetic alterations in tumors remains obscure. Work in the lab, which uses MAGEA1 as a model, aims at identifying the mechanisms that are responsible for DNA déméthylation in tumors.
The analysis of global gene expression data, which were performed in a variety of melanoma cell lines, revealed that MAGEA1 activation is often associated with loss of expression of the RAM2 gene (of unknown function). Our main objective is to unravel the molecular process that links RAM2 repression with MAGEA1 activation. Here we investigated the possibility that RAM2 repression and MAGEA1 activation may be two distinct consequences of a common epigenetic imbalance. To this end, we searched to identify the mechanisms involved in the repression of RAM2 in melanoma cell lines.
Our results show that RAM2 repression does not strictly rely on hypermethylation of its promoter region. Indeed, repression of this gene was not always associated with de novo DNA methylation of its promoter region, and was not alleviated when cells were treated with an inhibitor of DNA methylation. We then searched for the involvement of histone modifications. ChIP analyses demonstrated that RAM2 repression is associated with a local gain in methylation of lysine 27 of histone 3 (H3K27). We were able to show that EZH2 histone methyltransferase is involved in thos modification, since we observed recruitment of this enzyme within the promoter region of RAM2 in non-expressing cell lines. Moreover, EZH2 inhibition (with siRNA) induced RAM2 reactivation.
Recently, it has been proposed that DNA déméthylation in tumors may occur when precancerous cells transit through a phase of cellular senescence. Supporting evidence comes from the observation that the pRb protein, a key mediator of senescence, inhibits DNA methyltransferase activity. We propose that senescence may at the same time lead to the repression of RAM2, as it has been reported that pRb favors H3K27 trimethylation in some regions of the genome. Interestingly, we observed decreased RAM2 expression in senescent melanocytes Les profils de méthylation de l’ADN sont profondément altérés dans les tumeurs humaines. Certains gènes sont hyperméthylés et réprimés, d’autres gènes sont au contraire hypométhylés et activés. Le gène MAGEA1, par exemple, est hypométhylé et activé dans une grande variété de tumeurs. On connaît mal ce qui cause les remaniements de méthylation dans les tumeurs. Nos travaux visent à identifier les mécanismes responsables de la déméthylation de l’ADN dans les tumeurs, en utilisant le gène MAGEA1 comme modèle.
L’analyse de données d’expression génique globale dans une série de lignées de mélanomes a révélé que l’activation du gène MAGEA1 était souvent associée à la perte d’expression du gène RAM2 (de fonction inconnue). Le but de ce mémoire visait à établir le lien entre la répression de RAM2 et l’activation de MAGEA1. Nous avons investigué la possibilité que la répression de RAM2 et l’activation de MAGEA1 représenteraient deux conséquences distinctes d’un même processus de dérégulation épigénétique. Pour cela nous avons recherché les mécanismes responsables de la répression de RAM2 dans les lignées de mélanome.
Nos expériences démontrent que la répression de RAM2 ne repose pas sur l’hyperméthylation de son promoteur. En effet, la répression du gène n’est pas toujours associée à la méthylation de son promoteur, et n’est pas levée lorsqu’on traite les cellules avec un agent qui inhibe la méthylation de l’ADN. Nous avons donc recherché l’implication de modifications d’histone. Des analyses de la lysine 27 de l’histone3 (H3K27). Nous avons impliqué la méthyltranférase d’histone EZH2 dans cette modification, puisque nous avons observé le recrutement de cette enzyme au niveau du promoteur de RAM2 dans les lignées qui n’expriment pas la gène. Par ailleurs, l’inhibition d’EZH2 (par siRNA) induit la ré-activation de RAM2.
Récemment, il a été proposé que l’hypométhylation de l’ADN résulte du passage des cellules tumorales par un état de sénescence. La protéine Rb, un médiateur clé de la sénescence, inhibe en effet l’action des méthyltransférases d’ADN. Il est possible que la sénescence soit également responsable de la répression de RAM2. pRb est en effet capable de favoriser la méthylation de H3K27 dans certaines régions du génome. De façon intéressante, nous avons observé une diminution de l’expression de RAM2 dans des mélanocytes sénescents


Book
Quantification des lymphocytes T régulateurs présents dans des échantillons de tissu humains par mesure de la fréquence des séquences déméthylées de l’intron 1 de FOXP3

Loading...
Export citation

Choose an application

Bookmark

Abstract

Regulatory T cells (Treg cells) are CD4+ T cells specialized in the inhibition of immune responses. In our laboratory, we which to determine whether Treg cells contribute to the immunosuppressive environment which seems to prevail within tumors, and may limit the efficiency of cancer vaccines. To that end, a method to quantify Treg cells in human tissues is necessary. The most specific human Treg well marker is a stable epigenetic modification of a region localized in the first intron of gene FOXP3 which codes for a transcription factor essential to Treg cells. This region, named FOXP3il, is demethylated in Treg cells but completely methylated in other types of T cells. We tested the use of a methyl-specific quantitative PCR assay (MS-qPCR) to measure Treg cell frequencies in different types of human tissues.
We first verified that this assay could serve to quantify Treg cells in PBMC samples. We next applied the assay to measure Treg cell frequencies in PBMC samples from melanoma patients receiving cancer vaccines combined to potentially Treg cell-depleting therapies. No significant decrease of Treg cell frequencies was observed in six patients treated with Ontak, a diphtheria toxine-conjugated recombinant IL-2. A 50% or more decrease of Treg cell frequencies was observed in one of eleven patients treated with low dose Cyclophosphamide, and in four of thirteen patients treated with Daclizumab, a monoclonal anti-CD25 antibody. No variation of Treg cell frequencies was observed in patients treated with a cancer vaccine alone, nor in non vaccinated patients. In conclusion, by using an MS-qPCR technique that detects Treg cells but not activated T cells, we show that none of the potentially Treg cell-depleting therapies tested here can effectively decrease circulating Treg cell frequencies in a majority of patients. We also attempted to use the MS-qPCR assay to measure Treg cell frequency in tumor biopsies. However, we observed that melanoma cells may harbour demethylated FOXP3il sequences. We confirmed and extended this observation to two other regions of the FOXP3 gene using another technique named “bisulfite sequencing”. We observed different profiles of FOXP3 demethylation in melanoma cell lines. No demethylation of FOXP3il was observed in other types of tumors. In melanoma, demthylation of the FOXP3 gene was not correlated with FOXP3 mRNA expression.
In conclusion, the MS-qPCR FOXP3il assay allowed us to measure Treg cell frequencies in human PBMC samples. Its use on melanoma fragments without prior CD4+ T cell isolation will not be possible because tumor cells may also bear a demethylated FOXP3il allele Les lymphocytes T régulateurs (Treg) sont des cellules CD4+ spécialisées dans l’inhibition des réponses immunitaires. Notre laboratoire cherche à déterminer si les Treg contribuent à l’environnement immunosuppresseur qui existe au sein des tumeurs, et qui limiterait l’efficacité des vaccins anti-tumoraux. Pour ce faire, une méthode de quantification des Treg dans les tissus humains est nécessaire. La déméthylation d’une région de l’intron 1 du gène FOXP3, qui code pour un facteur de transcription essentiel aux Treg, est le marqueur le plus spécifique de l’état de méthylation de l(intron 1 de FOXP3 (Ms-qPCR FOXP3i1) pour évaluer la fréquence des Treg dans différents types de tissus humains.
Nous avons vérifié la spécificité de cette technique pour quantifier les Treg dans des échantillons de PBMC. Nous l’avons ensuite appliquée pour mesurer la fréquence des Treg dans des PBMC provenant de patients atteints de mélanome sous divers protocoles de vaccination anti-tumorale incluant l’administration d’un traitement visant à dépléter les Treg. Aucune diminution significative de la fréquence des Treg n’a été observée chez les six patients traités à l’Ontak, une protéine de fusion entre l’IL-2 et la toxine diphtérique. Une diminution de 50% ou plus de la fréquence des Treg a été observée chez un seul des onze patients traités par faible dose de cyclophosphamide, et chez quatre des treize patients traités au Daclizumab, un anticorps monoclonal anti-CD25. Aucune variation de la fréquence des Treg n’a été observée chez les patients recevant un vaccin anti-tumoral seul, ou chez des patients non vaccinés. En conclusion, en utilisant une technique de Ms-qPCR qui détecte les Treg mais pas les lymphocytes T activés, nous avons montré qu’aucun des traitements testés ici ne diminue significativement la fréquence des Treg circulants chez la majorité de patients.
Nous avons également cherché à utiliser la technique de Ms-qPCR pour mesurer la fréquence des Treg dans des biopsies de tumeurs. Cependant, nous avons observé que des cellules tumorales pouvaient porter des séquences FOXP3il déméthylées. Nous avons confirmé et étendu cette observation à deux autres régions du gène FOXP3 en utilisant une autre technique nommée « séquençage bisulfite ». Nous avons observé différents profils de déméthylation du gène FOXP3 dans les mélanomes, mais aucune déméthylation de la région FOXP3il n’a été observée dans d’autres types de tumeurs. Dans les mélanomes, la déméthylation du gène FOXP3 n’est pas corrélée avec l’expression de son ARN messager.
En conclusion, la MS-qPCR FOXP3il est une méthode qui nous a permis de mesurer la fréquence des Treg dans les échantillons de PBMC humains. Son utilisation dans des fragments de mélanome sans purification préalable des lymphocytes T CD4+ semble compromise puisque des cellules tumorales peuvent également porter un allèle FOXP3il déméthylé

Listing 1 - 2 of 2
Sort by


Copyright ©2024 SemperTool