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IFNs form a family of multifunctional cytokines notably involved in antiviral defence, cell growth control, apoptosis and modulation of the adaptive immune response. Type –I IFNs, like IFN-α, IFN-β, IFN-ω, and limitin, are produced in response to viral infection. They activate a signal transduction cascade leading to the transcriptional activation of many genes. Most murine IFNs turned out to be N-glycosylated . However, little is known on the influence of N-linked sugars on the activity of these cytokines.
This work aimed to characterize the glycosylation sites of selected murine type-I IFNs and to evaluate the influence of IFN glycosylation on their antiviral and antiproliferative activities. Three IFNs were analyzed: IFN-β which possesses 3 potential N-glycosylation sites, IFN-α13 which possesses 2 potential N-glycosylation sites, and IFN-α6T which is not glycosylated.
We used site-directed mutagenesis to eliminate or to introduce N-glycosylation sites in these molecules. Mutants were then compared to the parental forms to check their glycosylation status and to compare their activities in vitro.
Our data show that the three N-glycosylation sites predicted by the sequence of IFN-β and the two sites predicted by the sequence of IFN-α13 and IFN-α6T, the presence or the absence of sugars had only little influence on their activity in vitro Les IFNs sont une famille de cytokines multifonctionnelles impliquées dans la défense antivirale, dans le contrôle de l’apoptose, dans le contrôle de la croissance cellulaire et dans la modulation de la réponse immunitaire. Les IFNs de type I, comme les IFNs-α, β, ω et la limitine, sont produits en réponse à l’infection virale. Ils exercent leurs actions via des cascades de transduction du signal qui mènent à l’induction de la transcription de nombreux gènes. La plupart des IFNs murins sont N-glycosylés. Cependant, nous ne savons que peu de choses sur l’implication des glycosylations sur l’activité de ces cytokines.
Le but de ce travail était de caractériser les sites N-glycosylation de deux sous-types d’IFNs murins et d’étudier l’influence de cette glycosylation sur l’activité antivirale et antiproliférative de ces IFNs. Les 2 IFNs choisis sont : l’IFN-β dont la séquence comporte 3 sites potentiels de N-glycosylation et l’IFN-α13 dont la séquence en comporte 2. L’IFN-α6T qui ne possède pas de site de N-glycosylation a été étudié comme témoin.
Afin d’identifier les sites réellement glycosylés, nous avons, par mutagénèse dirigée, ajouté ou supprimé 1 ou plusieurs sites de glycosylation à ces IFNs. Nous avons ensuite analysé les mutants produits pour déterminer dans quelle mesure la glycosylation des IFNs influençait leur activité biologique, antivirale ou antiproliférative.
Les résultats obtenus nous montrent que les 3 sites putatifs de l’IFN-β et que les 2 sites putatifs de l’IFN-α13 sont effectivement occupés par des sucres, mais à des degrés divers. L’observation des activités antivirale et antiproliférative nous montre que, pour l’IFN-α13 et l’IFN-α6T, l’ajout ou la suppression de sites de glycosylation n’aurait que peu de conséquences sur leur activité biologique in vitro

Glycosylation --- Interferon-beta --- Interferon-alpha

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Theiler’s virus is a murine neurotropic virus which belongs to the Picornaviridae family. Persistent strains of this virus can produce a lifelong infection of the spinal cord, in spite of a strong immune response directed against the virus. Persistence of the virus in the spinal cord white matter induces a demyelinating disease reminiscent of human multiple sclerosis.
The L* protein expressed by Theiler’s virus is an important persistence determinant. This protein is encoded by an alternative open reading frame overlapping the main reading frame of the viral genome.
The aim of the present work was to precise the subcellular localization of protein L* , and to identify the corresponding targeting signals on the protein.
Therefore, we used confocal microscopy to analyse the subcellular distribution of the L* protein expressed by DA1 virus, or of a plasmid-encoded EGFP- L* fusion protein.
Our results show that L* colocalizes with mitochondria. This localization contrasts with the formerly reported association of L* with microtubules.
These results also suggest a link between L* protein expression and cellular apoptosis.
We then constructed a series of EGFP- L* deletion mutants to identify the mitochondria targeting signal(s) within L*. We observed that, except for a small C-terminal portion of the protein, any deletion introduced in L* prevented association of the fusion protein with mitochondria, suggesting that the targeting signal is conformational Le virus de Theiler est un virus neurotrope appartenant à la famille Picornaviridae. Les souches persistantes du virus ont la capacité de persister au niveau de la substance blanche de la moelle épinière. Cette persistance virale est accompagnée de lésions de démyélinisation semblables à celles retrouvées chez les malades souffrant de la sclérose en plaques. Parmi les éléments déterminant cette persistance virale, la protéine L* joue un rôle crucial dans l’établissement de cette persistance. Cette protéine est exprimée par un cadre de lecture alternatif chevauchant le cadre de lecture principal du génome viral.
L’objectif de ce travail de mémoire était, d’une part, de préciser la localisation subcellulaire de la protéine L* et, d’autre part, d’identifier les signaux de cette protéine déterminant sa localisation.
Nous avons analysé, par microscopie confoncale, la localisation de la protéine L* exprimée par le virus DA1 ainsi que celle d’une protéine de fusion EGFP-L*. Les images obtenues montrent la colocalisation de la protéine L* et des mitochondries. Cette localisation subcellulaire de la protéine L* contraste avec celle décrite précédemment, qui indiquait une association de cette protéine aux microtubules.
L’association de la protéine L* et des mitochondries indique que cette protéine pourrait avoir une fonction liée à l’apoptose cellulaire.
A partir d’une construction exprimant une fusion EGFP- L*, nous avons construit une série de mutants comportant des délétions de tailles variables des parties N et C-terminales de la protéine L*. A l’exception d’un petit domaine C-terminal, nous n’avons pas pu supprimer de segment de la protéine L* sans perdre la localisation mitochondriale de la protéine de fusion. Ces résultats suggèrent un adressage conformationnel de la protéine L* aux mitochondries

Theilovirus

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Theiler’s virus is a Piconavirus responsible for infections of the central nervous system of the mouse. Theiler’s virus strains are classified into two subgroups, neurovirulent strains or persistent strains, according to the disease they provoke.
Two molecular clones of the same neurovirulent strain (GVDII) of Theiler’s virus have been isolated independently in the laboratory of M. Brahic and in the laboratory of H. Lipton. Viruses produced from these plasmid clones are named GVDII-MB and GVDII-HL, respectively. However, although reported capsid amino acid sequences of these clones only differ at one position (VP2-126), GVDII-HL was reported to bind heparan sulfat (HS) for entry into cells while GVDII-MB did not.
The aim of this study was to test influence of amino acid VP3-126 of these viruses in HS binding.
We first confirmed that soluble heparan sulfate did not affect entry of GVDII-MB. We constructed two independent mutant viruses derived from GVDII-MB in which the VP3-126 Leu was replaced by the Arg codon found in GVDII-HL. Although viral genomic RNA transcribed from these constructs was able to replicate in BHK-21 cells, they failed to generate infectious viral progeny. This suggests that the Leu to Arg replacement at VP3-126 could prevent capsid assembly or could render the capsid non-infectious. Sequencing work revealed that the VP3-126 codon of the molecular clone of H. Lipton was a Leu codon as reported. In conclusion, both clones have the VP3-126 Leu codon and mutation of this codon to Arg makes the capsid non-infectious. It is not clear why these two clones have reportedly different HS-binding properties Le virus de Theiler est un Picornavirus qui provoque une pathologie du système nerveux central chez la souris. Les souches du virus de Theiler sont classées en deux sous-groupes, les souches neurovirulentes et les souches persistantes, en fonction de la maladies qu’elles causent.
Deux clones moléculaire de la souche neurovirulente CDVII du virus de Theiler ont été isolés indépendamment par l’équipe de M. Brahic et celle de H. Lipton. Les virus produits à partir de ces clones ont été respectivement appelés GDVII-MB et GDVII-HL. Les séquence disponibles de ces virus indiquent que leur capside ne diffère que par une seul acide aminé en position VP3-126. Néanmoins, il semble que le virus CDVII-HL utilise l’héparan sulfate (HS) comme corécepteur pour infecter la cellule alors que le virus GDVII-MB ne se lierait pas à cette molécule.
L’objectif de ce mémoire a été de tester l’implication de l’acide aminé VP2-126 de la capside de la souche neurovirulente GDVII dans la liaison à l’HS.
Dans un premier temps, nous avons confirmé que l’héparan sulfate soluble n’affecte pas l’entrée du virus GDVII-MB. Ensuite, nous avons construit des virus mutants dérivés du virus GDVII-MB dans lesquels le codon VP3-126 Leu a été remplacé par le codon Arg présent chez le virus GVDII-HL. Bien que l’ARN de ces construction s’est avéré capable de se répliquer dans les cellule sBHK-21, nous n’avons trouvé aucune évidence de formation de particules virales infectieuses pour ce mutant. Ceci suggère que l’Arg introduite en position VP2-126 empêche l’assemblage de la capside ou rend le virus non-infectieux. Le séquençage partiel du plasmide utilisé par H. Lipton pour produire le virus a révélé que le codon en VP3-126 de ce clone était un codon Leu comme dans le clone obtenu dans le laboratoire de M. Brahic, et non un codon Arg comme rapporté. En conclusion, les deux clones moléculaires ont un codon Leu en VP3-126 et la mutation de ce codon en Arg rend la capside non-infectieuse. La raison de la différence d’interaction avec l’HS observé entre les virus GDVII de deux laboratoire n’est pas connue

Heparitin Sulfate --- Theilovirus --- Amino Acids

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Sur base d’une homologie observée entre les protéines chaperons SycE et SycH de Yersinia enterocolitica et la protéine A156 des Escherichia coli entéropathogènes (EPEC), nous avons entrepris un travail constant à caractériser le gène Eae et la protéine qu’il encode. Par PCR, nous avons amplifié l’ADN correspondant à trois fragments du gène A156 : un fragment interne du gène, le gène entier et enfin le gène entier flanqué des 188 premiers codons du gène Eae, le gène adjacent.
Ces différents fragments d’ADN ont été clonés dans des vecteurs permettant soit la mutagénèse du gène sauvage, soit la complémentation du mutant, soit encore l’expression de la protéine dans E. coli K12. La mutagénèse du gène A156 a été réalisée par la méthode d’intégration-disruption. La mutation introduite a été contrôlée par hybridation Southern et amplification PCR. Le comportement du mutant A156 vis-à-vis des cellules Hep-2 a été analysé par le FAS test qui met en évidence la concentration d’actine au point de contact avec la bactérie. Contrairement à une souche sauvage, le mutant A156 s’avère incapable de former la lésion caractéristique des EPEC. Ce phénotype est le même que celui décrit pour un mutant Eae, ce qui suggère que le gène A156 est de fait impliqué dans la régularisation de l’expression de la protéine Eae. Des essais de complémentation de la mutation A156 par l’introduction du gène A156 intact n’ont cependant que partiellement restauré le phénotype sauvage. La raison la plus probable en est que la mutation que nous avons introduite est polaire ou partiellement polaire, et donc exerce ses effets non seulement sur le gène A156 mais également sur le gène Eae situé en aval.
Nous avons visualisé la protéine codée par le gène A156 par expression et marquage dans E. coli K12 au moyen du système de l’ARN polymérase du phage T7. La masse moléculaire de la protéine A156 a été estimé à 15kDa environ, ce qui est en accord avec la masse moléculaire déduite de la séquence nucléotidique. Cette protéine marquée a été utilisée dans une expérience visant à mettre en évidence une liaison entre la protéine A156 et sa cible probable, la protéine Eae. La technique utilisée n’a pas pu rendre compte de cette liaison. Contre toute attente, c’est une liaison entre la protéine A156 et une protéine ubiquitaire (probablement OmpA) qui a été observée. Une autre liaison a été observée entre les protéines A156 des EPEC et YopE de Y. enterocolitica. Cette dernière est probablement artéfactuelle dans la mesure où des expériences génétiques de complémentation réalisées ensuite n’ont pas permis d’attribuer un rôle de substitution à la protéine A156 dans la régulation de l’expression de la protéine YopE

Enteropathogenic Escherichia coli --- Medical Laboratory Science --- Escherichia coli --- Yersinia enterocolitica

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Theiler’s virus produces, according to the strain, an acute or chronic disease of the central nervous system of the mouse. The neurovirulent strains such as GD7 produce a fatal encephalitis while persistent strains such as DA induce a persistent disease and demyelisation in susceptible mice, despite the immune response. The persistent strain DA unlike the neurovirulent strain GD7 synthesis a protein called 1*. The latter protein increases the infection rate of macrophages by the virus. Macrophages are thought to play an important role in viral persistence and probably in the pathology induced by the virus. Enhancement of macrophage infection by protein 1* was reported to correlate with an antiapoptotic activity of this protein.
Cellular mutants resistant to the GD7 virus have been derived L929 cells in our laboratory. Those mutants have benne classified into 3 groups according to their resistance of susceptibility to different viruses. Some of these cellular mutants (including L929#25 and L929#34) exhibit a particular profile when infected by those viruses. It has turned out that the 1* protein and the replication regions (2A to 3B proteins), beside the viral capsid, influence the infection of these cellular mutants.
We have shown that the presence of the 1* protein and of the 2A-3B region of the DA virus enhance the infection of macrophages. Thos results prompted us to further characterise the L929#25 and L929#34 cellular mutants. We observed that the resistance of those mutants involve a very early stage of the viral cycle (probably just after or the entry of the virus into the cell) and not an increase of their susceptibility to apoptosis as we previously thought. We also constructed and tested new recombinant viruses in attempt to identify the factor of the 2A-3B region that promotes the infection of macrophages and of the cellular mutants. Le virus de Theiler provoque, selon les souches, une maladie aiguë ou chronique du système nerveux central de la souris. Les souches neurovirulentes, comme la souche GD7, provoquent une encéphalite mortelle tandis que les souches persistantes comme la souche DA causent, chez les souris susceptibles, une maladie persistante et démyélinisante en dépit de la réponse immunitaire. LA couche persistante DA exprime, contrairement à la souche neurovirulente GD7, la protéine 1*. Cette dernière facilite l’infection des macrophages, réservoir potentiel du virus lors de la persistance. L’action de cette protéine pourrait s’exercer par un effet antiapoptotique.
Des mutants cellulaires L929 devenus résistants à l’infection par le virus GD7 ont été obtenu dans notre laboratoire. Certains de ces mutants cellulaires (dont les lignées L929#25 et L929#34) présentent un profil d’interaction particulier par les différents virus. Il s’avère que la protéine 1* et la région de réplication (protéines 2A à 3B), outre la capside virale, influencent l’infection de ces mutants.
Nos avons montré que l’infection des macrophages est également facilitée par la présence de la protéine 1* et de la région 2A-3B du virus DA. Cela nous a poussé à caractériser d’avantage les mutants L929#25 et L929#34. Nous avons observé que la résistance de ces mutants intervient dans une étape très précoce du cycle viral (sans doute juste au moment ou après l’entrée du virus dans la cellule) et ne provient pas d’une augmentation de leur sensibilité à l’apoptose comme nous le pensions ? Nous avons construit et testé des virus recombinants pour tenter de mettre en évidence le facteur présent dans cette région 2A-3B qui favorise l’infection des macrophages et des mutants cellulaires.

Theilovirus --- Macrophages --- Infection