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The aim of our work was to produce soluble class II HLA complexes HLA-DP4, loaded with a peptide from the MAGE-3 tumoral antigen. These complexes will be used to from fluorescent tetramers for the analysis of the anti-tumoral T helper response of patients vaccinated with the MAGE-3 peptide. Two methods were valuated : i) the production of these complexes from recombinant proteins expressed by bacterial systems and refolded in vitro, ii) the expression of these complexes by insect cells.
We evaluated the production of the complexes from the fusion protein of β1 and α1 domains expressed by bacteria. The refolding of this protein only allowed to obtain high molecular weight complexes and a dimmer of the fusion protein. The high molecular complexes are able to stimulate the production of IFN-γ by a CD4+ T-Cell clone directed against anti-MAGE-3.DP4 and isolated from a vaccinated cancerous patient. This indicates that in these complexes molecules exist loaded with the antigenic peptide and are in adequate conformation to present it.
We also produced MAGE-3.DP4 complexes secreted by Drosophila cells. The biological function of the secreted complexes was then confirmed by their ability to stimulate the production of IFN-γ by anti-MAGE-3.DP4 CD4+ T-Cell clones. Finally, we selected and maintained in culture transfected Drosophila cells that secrete MAGE-3.DP4 complexes in a stable manner. After purification, these complexes will be ready for the production of fluorescent tetramers. These tetramers will be tested for their ability to specifically label the anti-MAGE-3.DP4 CD4+ T-Cell clones before their use in the analysis of anti-tumoral T helper response of vaccinated patients Le but de notre travail était la production de complexes HLA de classe II solubles HLA-DP4, charges d’un peptide issu de l’antigène tumoral MAGE-3. Ces complexes serviront à former des tétramères fluorescent pour l’analyse la réponse anti-tumorale T auxiliaire chez des patients vaccinés à l’aide du peptide MAGE-3-DP4. Deux approches ont été évaluées : i) la production des complexes à partir de protéines recombinantes exprimées en système bactérien et reployées in vitro, ii) l’expression des complexes en cellules d’insectes.
Nous avons évalué la production des complexes à partir d’une protéine de fusion des domaines β1 et α1 exprimée en bactérie. Le reploiement de cette protéine n’a permis d’obtenir que des complexes de haut poids moléculaire aussi qu’un dimère de la protéine de fusion. Les complexes de haut poids moléculaire sont capables de stimuler la production d’IFN-γ par un clone de lymphocyte T CD4+ anti-MAGE3.DP4, isolé d’un patient cancéreux vacciné. Ceci indique qu’il existe dans ces complexes des molécules chargées du peptide antigénique et dans une conformation adéquate pour la présentation de l’antigène.
D’autre part, nous avons produit des complexes MAGE-3.DP4 sécrétés par des cellules de Drosophile. La fonction biologique des complexes sécrétés a ensuite été confirmée par leur capacité à stimuler différents clones de lymphocytes T CD4+ anti-MAGE3.DP4 pour la production d’IFN-γ. Enfin, nous avons sélectionné et maintenu en culture des cellules de Drosophile transfectées qui sécrètent de façon stable les complexes MAGE-3.DP4. Après avoir été purifiés, ces complexes pourront servir à la production de tétramères fluorescents.
Ces tétramères seront testés pour leur capacité à marquer spécifiquement les clones de lymphocytes T CD4+ anti-MAGE-3.DP4 avant d’être utilisés pour l’analyse de la réponse anti-tumorale T auxiliaire chez des patients cancéreux vaccinés

Antigens, Neoplasm --- MAGEA3 protein, human --- T-Lymphocytes

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L’allergie est un problème de santé publique majeur avec doublement de la prévalence en quelques années. C’est une raison de plus en plus fréquente de consultation chez son médecin. Il est possible en plus de traitements médicamenteux, de recourir à l’immunothérapie spécifique ou désensibilisation pour « guérir » cette maladie. L’immunothérapie est utilisée dans les allergies causées par des pneumallergènes et venins d’hyménoptères. Les voies principales d’administration sont les voies sous-cutanée et sublinguale (ITSL) (la voie nasale étant un peu mise à l’écart).
L’immunothérapie spécifique (ITS) ou désensibilisation consiste à administrer périodiquement au patient allergique, des doses croissantes d’allergène auxquels il et sensible. Cette administration induit chez lui une tolérance et une réduction des réactions lors des contacts ultérieurs avec l’allergène responsable.
De très bons résultats sont obtenus par les deux voies. La vois sous-cutanée étant la plus répandue et donc la plus étudiés, mais la sublinguale, présentant moins d’effet secondaires et plus pratique pour l’administration de l’allergène, regagne du terrain. Des résultats sont constatés après un an peuvent persister pendant une longue durée après l’arrêt du traitement

Immunotherapy --- Desensitization, Immunologic --- Hypersensitivity

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MAGE-A1 gene belongs to the group of cancer-germline genes which are normally expressed specifically in the male germ cells, and are aberrantly activated in tumors of various histological types. The activation of these genes in tumors reveals antigens recognized by cytolytic T lymphocytes, which are important in cancer immunotherapy.
Previous work showed that the repression of MAGE-A1 gene in normal somatic tissues is due to the methylation of its promoter and that its activation tumors results from a process of DNA demethylation. At the present, the mechanisms responsible for the demethylation of MAGE-A1 gene in the tumors remain to be elucidated.
A recent study undertaken by the team of Victor Lobanenkov (NIH, Bethesda, USA) suggests that BORIS, a transcription factor, specifically expressed in the testis, would be directly responsible for the activation for MAGE-A1 gene and other cancer-germline genes in tumors. Their work indeed shows that, (i) BORIS is activated in a large majority of tumor samples, (ii) the induction of MAGE-A1 gene following treatment by the demethylating agent requires preliminary activation of BORIS, (iii) the overexpression of BORIS by transient transfection induces MAGE-A1 gene activation in normal fibroblasts.
Our objective was to check these assertions. Contrary to the results described by the Lobanekov group, we observed the activation of BORIS gene in a minority of tumor cell lines and tumor tissues. Moreover, a larger number of tumor samples express MAGE-A1 without BORIS. We also noted the absence of BORIS gene expression in clones where MAGE-A1 was activated following a demethylating treatment. Finally, in our experiments of transient transfection, the overexpression of BORIS did not induce activation of MAGE-A1 gene. We thus conclude that BORIS is not expressed in the majority of tumors and that it is not an essential factor for the activation of MAGE-A1 gene Le gène MAGE-A1 appartient au groupe des gènes “cancer-lignée germinale” qui sont normalement exprimés spécifiquement dans les cellules germinales mâles et sont activés de manière aberrante dans des tumeurs de types histologiques variés. L’activation de ces gènes dans les tumeurs fait apparaître des antigènes reconnus par les lymphocytes T cytolytiques. Ces antigènes sont donc utilisés en immunothérapie cancéreuse.
Certains travaux ont montré que la répression du gène MAGE-A1 dans les tissus somatiques normaux est due à la méthylation des son promoteur, et que son activation dans certaines tumeurs résulte d’un processus de déméthylation. A l’heure actuelle, les mécanismes responsables de la déméthylation du gène MAGE-A1 dans les tumeurs restent à élucider.
Une étude récente menée par l’équipe de Victor Lobanenkov (NIH, Bethesda, USA) suggère que BORIS, un facteur de transcription exprimé spécifiquement dans le testicule, serait directement responsable de l’activation du gène MAGE-A1 et d’autres gènes cancer-lignée germinale dans les tumeurs. Leurs travaux montrent en effet que (i) BORISest activé dans une très grande majorité des échantillons tumoraux, (ii) l’induction du gène MAGE-A1 suite au traitement par un agent déméthylant nécessite l’activation préalable du facteur BORIS, (iii) la surexpression du facteur BORIS par transfection transitoire induit l’activation du gène MAGE-A1 dans des fibroblastes normaux.
L’objectif de notre mémoire était de vérifier ces affirmations. Contrairement aux résultats décrits par le groupe de Lobanenkov, nous n’avons observé l’activation du gène BORIS que dans une minorité de lignées tumorales et tissus normaux. Par ailleurs, de nombreux échantillons tumoraux expriment MAGE-A1 sans exprimer BORIS. Nous avons également constaté l’absence de l’expression du gène BORIS dans des clones où MAGE-A1 a été activé suite à un traitement déméthylant. Finalement, dans nos expériences de transfection transitoire, la surexpression de BORIS n’a pas abouti à l’activation de MAGE-A1. Nous concluons donc que BORIS n’est pas exprimé dans la majorité de tumeurs et qu’il n’est pas un facteur obligé pour l’activation du gène MAGE-A1

MAGEA1 protein, human --- CTCFL protein, human --- Immunotherapy --- Antigens --- Transcription Factors --- T Lymphotytes, Cytotoxic --- Immunologic Tests